华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖的影响

潘心瑶 王成德 黄佩雷 潘进钱★

华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖的影响

潘心瑶 王成德 黄佩雷 潘进钱★

目的 探讨华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44增殖、凋亡的影响及其机制。方法 不同浓度华蟾素分别作用于SHG44细胞株，MTT法及流式细胞技术检测其对SHG44细胞株增殖的影响和对细胞周期的影响；（AO/EB）双重染色及透射电镜观察SHG44细胞株形态学变化和超微结构的改变；Westernblot技术检测Caspase8蛋白及Bcl-2的表达。结果 1μg/ml和10μg/ml浓度下的华蟾素显著抑制人脑胶质瘤细胞SHG44增殖作用（P＜0.05），并呈浓度和时间依赖性。FCM检测发现华蟾素可使人脑胶质瘤细胞SHG44的G0/G1期细胞明显增多（P＜0.05），可见凋亡峰；Western Blot检测显示华蟾素作用可使Caspase8蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调。结论 华蟾素能够诱导Caspase8和Bcl-2的差异性表达，具有抑制人脑胶质瘤细胞SHG44的细胞增殖，促进其凋亡的作用。

华蟾素 脑胶质瘤 细胞周期 细胞凋亡

脑胶质瘤为脑实质恶性肿瘤，发病率约5～10/10万，预后较差［1］。目前临床上以手术治疗为主，常难以切除彻底。目前化疗在脑胶质瘤的治疗中作用越来越重要，但化疗药物均有较大毒副作用，且存在耐药现象，因此急需找到一种抑瘤效果好，副作用小的新型化疗药物。华蟾素具有不良反应少、疗效明确效的优点，临床上广泛应用肝癌、肺癌等的辅助治疗［2～4］。本文通过研究华蟾素对脑胶质瘤细胞SHG44生物学影响，探讨其抑瘤机制，为脑胶质瘤的辅助治疗提供理论依据。

1　 材料与方法

1.1 一般材料 美国gibco公司的标准胎牛血清、DMEM培养基；安徽淮北金蟾药业公司生产的华蟾素注射液，与DMEM培养基混合配制成不同浓度的华蟾素药液，作用时间及浓度参照参考文献［5］；美国Sigma公司的四甲基偶氮唑蓝（MTT）、碘化丙啶（PI）、吖啶橙（AO）、二甲亚砜（DMSO）溴乙啶（EB）；美国SantaCruz公司的GAPDH抗体、二抗、Caspase8、Bcl-2。荧光显微镜（日本Nikon公司）。本院生物研究中心实验室提供人脑胶质瘤SHG44细胞株，于DMEM培养基中（含100U/ml青霉素、10%胎牛血清）常规培养。

1.2 方法 （1）MTT比色法检测华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44存活率的影响：将人脑胶质瘤细胞SHG44培养至对数生长期，取对数生长期细胞按照104个/每孔接种于96孔培养板中，并将其分为3组，细胞培养箱内放置24h后，分别向各组加入不同浓度的华蟾素（10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml），分别作用24h及72h；对照组为由单纯DMEM培养基上培养的人脑胶质细胞瘤细胞SHG44。在实验结束前于每孔中分别加入MTT（5g/L）20μl，振荡使其充分混匀，继续细胞箱内孵育4h后摈弃上清液，每孔内分别加入二甲基亚砜（DMSO）150μl，振荡1min，测定每孔490nm波长处吸光度（A值），并根据公式计算细胞存活率：细胞存活率=（实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。（2）流式细胞术（FCM）检测华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44周期及凋亡的影响：取对照组细胞及3组不同浓度华蟾素细胞，冷磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤2次，加入冷乙醇（70%）固定细胞、4℃下过夜。1000r/min转速离心10min后，摒弃上清液，加入RNaseA（200ug/ ml）和TritonX-100各200ul，37℃下放置15min，再加入荧光染料PI（100μg/ml）1ml，暗处室温下放置15min，应用流式细胞仪进行检测（荧光检测：发射波长670nm，激发波长490nm）。根据公式计算细胞凋亡情况：凋亡指数（APO）=（出现凋亡的细胞数/检测到的细胞数）×100%。（3）透射电镜（TEM）观察人脑胶质瘤细胞SHG44的超微结构改变：胰酶消化并获得所需细胞，1000r/min离心10min，摈弃上清液后冷却台上（4℃）预冷，固定2h（25g/L的戊二醛），磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，饿酸（10g/L）固定，梯度酒精脱水，常规包埋、聚合、切片、铅染、透射电镜观察。（4）吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双重染色观察细胞形态学变化：取对照组细胞及3组加入不同浓度华蟾素的细胞，将培养基吸去，分别向每孔加入吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）混合染色液10μl：100μg/ mlEB与100μg/ml AO等量混合均匀。静置10min后在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态学变化。（5）Western Blot检测：取对照组细胞及3组不同浓度华蟾素细胞，RIPA裂解液（含1% PMSF）提取细胞总蛋白，BCA法测定样品蛋白含量，磷酸盐缓冲液调整蛋白终浓度至1μg/μl，12%SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜，加入5%脱脂奶粉（TBST 溶解）封闭2h，放入相应的Caspase8（1∶1000）、兔抗人Bcl-2，孵育过夜（4℃），加入碱性磷酸酶（ALP）标记的二抗（羊抗兔）孵育2h（室温），ECL发光液显色，暗室曝光并拍照。经专业图像分析软件（Image-Pro Plus） 处理蛋白条带，通过光密度量化分析。

2　 结果

2.1 华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44 存活率的影响 SHG44细胞株接受不同浓度华蟾素处理24h、72h后发现：随着华蟾素的浓度增加和时间延长，SHG44细胞株的存活率呈现逐渐降低趋势，其作用具有剂量和时间的依懒性，剂量越大，时间越长，抑制作用越显著（F1=4.011，P＜0.01；F1=4.324，P＜0.01）。在10μg/ml、1μg/ml浓度的华蟾素处理下，SHG44细胞生长受到明显抑制（P＜0.05）；0.1μg/ml浓度的华蟾素细胞毒作用不明显（P＞0.05）。见表1。

表1 不同浓度华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44的存活率影响（±s）

表1 不同浓度华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44的存活率影响（±s）

华蟾素（μg/ml）　24h　72h A490nm 值　　存活率（%）　A490nm 值　　存活率（%）0.1　0.780±0.090　95.48　1.089±0.057　95.33 1.0　0.570±0.068　68.92　0.679±0.033　60.98 10.0　0.277±0.041　34.66　0.172±0.024　17.47对照组　0.809±0.079　　…　1.133±0.044　　…F值　4.011　-　4.324　-P值　P＜0.01　-　P＜0.01　-

2.2 华蟾素对人脑胶质瘤细胞SHG44凋亡率及细胞周期的影响 （1）华蟾素浓度越高，SHG44细胞株凋亡率越高（F=12.331，P＜0.01）；在10μg/ml、1μg/ml浓度的华蟾素作用下，SHG44细胞株凋亡率显著升高（P＜0.05）。（2）在10μg/ml、1μg/ml浓度的华蟾素作用下，S期和G2/M期的SHG44细胞数明显减少，细胞被阻滞于G0/G1期，不能向S期过渡，从而抑制细胞的分裂，出现典型凋亡峰。见表2。

表2 不同浓度华蟾素对人脑胶质瘤SHG44细胞周期及凋亡率影响（±s）

表2 不同浓度华蟾素对人脑胶质瘤SHG44细胞周期及凋亡率影响（±s）

华蟾素（μg/ml）　凋亡率（%）　　细胞周期（%）G0/G1　S　G2/M对照组　0.90±0.31　51.66±2.20　35.28±2.22　13.68±1.65 0.1　1.12±0.28　55.32±1.68　31.47±1.62　12.78±1.22 1.0　12.11±2.52　70.08±4.14　23.89±3.33　6.10±0.79 10.0　27.04±5.26　85.26±4.34　13.76±1.32　4.66±0.41 F值　12.331　12.604　11.594　10.594 P值　　＜0.01　　＜0.01　　＜0.01　　＜0.01

2.3 透射电镜观察SHG44细胞超微结构改变 对照组（单纯DMEM培养基）人脑胶质瘤细胞SHG44呈卵圆型，边缘可见少量微绒毛，细胞质内可见线粒体峭，细胞核核仁清晰，染色质无异常。10μg/ml浓度的华蟾素作用72h后，可见SHG44细胞边缘突出，凋亡小体可见，表面包裹细胞膜，凋亡小体内可见残存的细胞器和细胞核。染色质浓集成团块状。见图1。

2.4 吖啶橙/溴化乙锭（AO/EB）双重染色观察SHG44细胞凋亡 对照组（单纯DMEM培养基）未见明显凋亡的细胞。实验组（加入不同浓度华蟾素）可见早期凋亡细胞：吖啶橙（AO）染色下细胞核呈黄绿色荧光，浓聚成颗粒状，位于细胞的一侧。部分晚期凋亡细胞核为EB染色呈桔红色，浓聚和偏向；少数细胞核碎裂成块状。见图2。

图1 透射电镜下细胞超微结构的改变

图2 AO/EB染色观察细胞凋亡

2.5 Western Blot检测Caspase8蛋白、Bcl-2表达情况 10μg/ml、1μg/ml浓度的华蟾素作用48h后，实验组SHG44细胞的Caspase8蛋白表达较对照组升高（422±37）%、（149±17）%，差异有统计学意义（P＜0.01）。10μg/ml、1μg/ml浓度的华蟾素作用48h后，实验组SHG44细胞的Bcl-2蛋白表达较对照组下降（391±24）%、（172±18）%，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

3　 讨论

由于脑胶质瘤的侵袭性生长，其治疗一直是临床上的一个难题［6］。近年来某些传统中医药材因为毒性低、来源广、疗效可，逐渐开始成为临床上肿瘤治疗的一个新的手段。华蟾素为复方注射制剂，主要成分为吲哚类生物碱及蟾蜍毒精等，具有止痛、消炎、提高免疫力等作用。有研究表明［7～10］，华蟾素对如前列腺癌、骨肉瘤、乳腺癌等肿瘤细胞具有诱导分化和凋亡的作用，具有不良反应小，安全有效的优点。但其对于脑胶质细胞瘤的相关作用缺乏相关报道，因此，作者进行一系列华蟾素对人脑胶质细胞瘤SHG44作用的相关研究，旨在华蟾素在脑胶质细胞瘤治疗中的应用提供一定的理论和指导。

本资料显示，华蟾素对胶质瘤细胞具有抑制其生长的作用，10μg/ml浓度的华蟾素作用24h人脑胶质瘤细胞SHG44后其生长抑制率达72.23%，作用72h 达82.8%，其抑制作用具有剂量和时间的依赖性。为进一步探讨其抑制细胞生长的机制，作者应用FCM技术检测不同浓度华蟾素对SHG44细胞株细胞周期分布及凋亡及的影响发现，华蟾素作用于细胞72h后，S期及G2/M期的细胞明显减少，而G0/G1期细胞明显增加，细胞阻滞于G0/G1期从而有丝分裂受到影响，细胞生长受到抑制，并形成典型的亚G1峰。且在AO/ EB双重染色荧光显微镜下观察到典型凋亡细胞的形态学改变，透射电镜进一步观察到凋亡细胞的超微结构改变。有研究表明［11］，华蟾素能将肿瘤细胞的细胞周期阻滞在S期，因此达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。因此作者推测，华蟾素通过抑制SHG44细胞株的细胞周期进程，诱导细胞凋亡，从而抑制细胞增殖。

细胞凋亡指为更好的适应环境细胞自身发出的一个由基因控制的自主有序死亡的过程，其在肿瘤细胞的生长过程发挥着重要作用［12］。Bcl-2蛋白家族在细胞凋亡的效应期的调节过程中发挥着重要作用。Bcl-2蛋白家族根据其功能可分为两类蛋白亚群［13］：一类为促进凋亡蛋白（如Bik/Nbk、Bcl-Xs、Bak、Bax等）；另一类为抑制凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xY、Mcl-1、Bcl-xL等）。Bcl-2蛋白家族可通过影响线粒体巨孔的形成抑制细胞色素C（Cyt c）的释放，从而抑制细胞凋亡，同时其还可通过抑制凋亡诱导因子（AIF）抑制细胞的凋亡［14］。另外，Bcl-2蛋白可通过调节线粒体及内质网中的钙离子浓度，来保持胞内钙离子的动态平衡，从而避免线粒体中Ca2+浓度过高引发的细胞凋亡。Caspase8为Fas介导的细胞凋亡过程中的一个重要启动因子，其细胞凋亡过程有赖于一类对天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）产生的级联反应。Caspase8被切割激活后，可通过对下游的靶蛋白进行水解，产生细胞凋亡效应。本资料中，通过Western Blot检测发现，1μg/ml、10μg/ml浓度的华蟾素作用48h后可使Caspase8蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调。因此作者推测，华蟾素通过抑制上调Caspase8蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达来诱导人脑胶质瘤细胞SHG44凋亡，从而抑制其增殖。

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Objective To explore the influence of cinobufotalin on the proliferation and apoptosis of human glioma cell line SHG44 and its mechanism. Methods Different concentrations cinobufotalin were applied to SHG44 cell line，MTT assay cinobufacini on SHG44 cell line proliferation； fl ow cytometry cinobufacini SHG44 cell line for cell cycle； TEM ultrastructural changes SHG44 cell plant type，（AO / EB） double staining morphological changes； Westernblot Caspase8 to detect Bcl-2 protein and the expression. Results Cinobufotalin （1μg/ml and 10μg/ml concentration） inhibited human glioma cells SHG44 proliferation（P＜0.05），and in a dose and time dependent. FCM detected that cinobufotalin make human glioma cells SHG44 the G0 / G1 phase cells increased signifi cantly（P＜0.05），and can see the apoptotic peak； Western Blot test showed cinobufotalin role in bringing Caspase8 protein upregulation，Bcl-2 protein was down-regulated. Conclusion Cinobufotalin can induce differential expression of caspase 8 and Bcl-2，and play the role in inhibiting proliferation of tumor cells and accelerating apoptosis of SHG44 cells.

Cinobufotalin Glioma Cell cycle Apoptosis

325000 温州医科大学第一临床医学院（潘心瑶）325000 温州医科大学附属第一医院神经外科（王成德黄佩雷 潘进钱）
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1.3 统计学方法 采用SPSS17.0软件。计量资料用（±s）表示，同一个指标不同组之间的比较及各组间的两两比较采用方差分析；同指标两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。