发酵酒中尿素的检测

张颖，刘国新，胡翠翠，张健，*（.食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

发酵酒中尿素的检测

张颖1，刘国新2，胡翠翠2，张健2，*
（1.食品营养与安全教育部重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457；2.工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津300457）

发酵酒中尿素检测方法主要包括比色法、酶法和色谱法，综述了这3种方法的检测原理，并阐述了这些方法的优缺点及适用条件，最后展望了尿素检测的发展趋势

尿素；发酵酒；氨基甲酸乙酯；检测

尿素又称碳酰二胺、碳酰胺、脲，广泛存在于发酵酒中。除原料引入和人为添加外，酿酒酵母的氮代谢亦是发酵酒中尿素的主要来源。大量研究发现，尿素和乙醇在自然条件下反应可生成氨基甲酸乙酯（EC）［1-2］，而EC已经被证实是一种潜在的人类致癌物质。2002年，联合国粮农组织将EC纳入重点监控物质；2007年，国际癌症研究机构将EC认定为“2A”类致癌物；很多国家已经制定了氨基甲酸乙酯在不同发酵酒中的限量标准［3］。虽然EC的前体物质很多，但尿素被认为是EC的主要前体，尿素的含量可以反映发酵酒中潜在的EC含量。不仅如此，尿素还在酵母的氮代谢中扮演重要角色，并通过氮代谢物阻遏效应影响酵母对其他氮素的吸收，从而影响发酵酒的品质。因此准确测定发酵酒中的尿素含量具有重要的意义。

1　发酵酒中尿素的检测方法

尿素的检测方法很多，每种方法都有自身的局限性和适用范围，尚无通用的可检测任何样品中尿素含量的方法［4-6］。如在临床医学领域，酶法测定尿素较为适宜，这是因为酶法测定速度快、安全无毒；而在环境领域，非酶法更为常用，这是因为环境中可能会存在酶抑制剂，这会影响酶法测定的准确性。发酵酒品种多样、基质复杂，尿素含量差别很大。如葡萄酒中的尿素含量通常在3 mg/L以下，而日本清酒中的尿素含量在5 mg/L～80 mg/L之间［7］。尿素在发酵酒酿造过程中处于不断的动态变化中，在不同的发酵阶段其含量可能低至μg/L的水平。这些特点要求发酵酒的尿素测定方法要具备高灵敏度、精密度和准确度。迄今为止，发酵酒中尿素的检测方法主要分为3类：比色法、酶法和色谱法。本文将综述这些方法，分析其优缺点及适用条件，并展望尿素检测方法的发展趋势。

1.1比色法

尿素与显色剂在一定条件下反应生成带有颜色的化合物，该化合物颜色深浅程度与样品中尿素含量呈正比，因此可以通过测定特定波长下反应溶液的吸光值来确定样品中的尿素含量。已报道的尿素显色反应很多，但测定尿素的只有两大类，即基于二乙酰一肟的反应和基于2-异亚硝基苯丙酮的反应，每类反应又有很多的改进和修饰。

1939年，Fearon研究发现尿素和二乙酰在酸性条件下反应显黄色，而不同的尿素氨基取代物能和二乙酰（图1a）反应生成红色、暗红色或紫红色化合物，该反应即为Fearon反应［8］。二乙酰一肟和尿素的显色反应正是由Fearon反应演化而来的，使用二乙酰一肟（图1b）取代二乙酰作为反应物克服了二乙酰稳定性差的缺点，其基本反应原理为，二乙酰一肟首先在酸性条件下解离为二乙酰和羟胺，然后二乙酰与尿素在酸性、加热的条件下形成红色衍生物，该反应产物颜色深浅程度与样品溶液中尿素含量呈正比。此后，众多学者在提高该检测方法的精密度和准确性等方面做了大量工作［9］，如在反应体系中加入氨基硫脲可有效钝化红色产物的光敏性，显著提高该物质的颜色稳定性，增大线性范围；加入Fe3+可除去反应二乙酰一肟水解副产物羟胺，从而增强反应显色效果；加入安替比林或4-氨基安替比林可增大反应的线性范围。

图1　光谱测量的试剂Fig.1　Spectrophotometric reagents

二乙酰一肟法是检测游泳池水中尿素的国标方法，也普遍应用于测定环境样品和发酵酒等样品中的尿素。1970年，Douglas等［10］采用该法来测定土壤样品中的尿素，2004年，Hasnip等［11］在研究时间和温度对葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的影响时，采用该法在3年的时间跨度内准确测定了尿素含量。陈宜宜等［12］添加氨基硫脲和氯化铁改进该法，在酸性条件下成功检测了黄酒中的尿素。梁新红等［13］通过优化反应条件，显著提高了该方法的精密度和准确度，测定葡萄酒中的尿素含量，检测限可达0.5 mg/L，能够满足葡萄酒样品中尿素常规检查的要求。

1989年，Ough等［14］建立了另一种比色法，即采用1-苯基-1，2-丙二酮-2-肟（2-异亚硝基苯丙酮；图1c）作为基础试剂与尿素反应，然后在540 nm下检测吸光值。这种方法已被Ough和许多学者应用于酿酒酵母的氨基酸代谢研究和葡萄酒中氨基甲酸乙酯形成的研究。1-苯基-1，2-丙二酮-2-肟与二乙酰一肟相比，稳定性更好，并且没有难闻的气味，但产生的有色产物对光更加敏感，导致试验结果的重现性和稳定性比较差。Nagel［15］和Monteiro的报道中［16］，葡萄酒中尿素的检测限均为1 mg/L，但也有报道采用该法测定尿素检测限更低［17］。

综上，比色法涉及的试剂较多，且有很多修饰和改进，不同的反应条件导致产物颜色不尽相同，从而影响到了检测波长的选择以及检测的灵敏度和准确度。只有通过系统性研究，明晰各种比色法的优缺点和适用条件，才能充分发挥各种方法的优势，才能规范针对发酵酒中尿素检测的比色法。

1.2酶法

脲酶（EC3.5.1.5）又称尿素酰胺水解酶，相对分子质量为120 000 Da～130 000 Da，广泛存在于豆类植物籽实和细菌中，能特异性水解尿素形成氨气和二氧化碳。大多数脲酶的最适pH在中性或偏碱性范围内，但是源于肠道乳酸菌体内的酸性脲酶最适pH在2～4之间。酸性脲酶非常适合在发酵酒环境中分解尿素，生成的氨气或二氧化碳，通过测定生成的氨气或二氧化碳含量，即可间接测定尿素含量。体系中的pH、乙醇、有机酸和氟化物的含量对酸性尿酶活力有一定的影响［18］，因此在测定尿素前需要对样品进行前处理，使酸性脲酶能在最适条件下反应。

现已开发出基于酶法中氨气测定的尿素检测试剂盒，广泛应用于发酵酒中的尿素检测［19-20］。其原理是利用酸性脲酶水解尿素生成氨气和二氧化碳（反应式1），氨气与2-酮戊二酸和原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）在谷氨酸脱氢酶（GLDH）作用下反应生成谷氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和水（反应式2）。在340 nm处检测NADH的吸光值，根据NADH的减少量与氨的减少量成正比，即可测定样品中的尿素含量。样品的色泽和浑浊度对测定有一定的干扰，因此需用聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）吸附样品中的色素，并用0.45 μm滤膜过滤除杂。试剂盒可以测定25 μL～50 μL的微量样品，通过增加样品含量可实现对样品中微量尿素的定量。由于试剂盒内NADH不稳定，容易被氧化，会造成吸光度下降，因此在每次测量前需要重新进行定标。此方法对尿素标品的检测限通常为0.15mg/L，但对于实际样品中的尿素，检测限仅为1 mg/L［21］。

Satoh等［22］将脲酶固定化，通过温度控制的气体扩散单元将直接氨气导入溴百里酚蓝溶液，在596 nm下测量百里酚蓝溶液的吸光值来确定尿素的含量，开发了流动注射-分光光度法提高了尿素测定的准确度、精密度和自动化程度。Ilda等［23］开发了类似的方法来检测清酒中尿素的含量。因为清酒中的其他的氨类物质含量很高，可达尿素含量的6倍～10倍，所以该方法采用了离子交换法对样品进行前处理。只要样品中的乙醇浓度低于5%，尿素检测就不受影响，线性范围在0.5 mg/L～60 mg/L。Ilda课题组［24］还用该法测定了黄酒中的尿素含量，并且与前述的试剂盒法测定的结果进行了对比，结果无显著差别。

基于酶法中二氧化碳的测定亦可检测尿素［25-26］。将样品流动注射到载有酸性脲酶的固体柱里，通过气体扩散装置分离的二氧化碳，透过膜扩散到溴百里酚蓝溶液中，通过测定溶液在617 nm处的吸光度来检测二氧化碳的含量，进而得出尿素的浓度。该法无需去除样品中的其他氨类物质，但尿素水解所产生的二氧化碳含量仅是氨气含量的一半（反应式1），并且有潜在空气污染的危险。Iida等［27］采用了标准添加技术，大大地提高了该法检测尿素的灵敏度。

1.3色谱分离法

过去，采用高效液相色谱法（HPLC）测定发酵酒中尿素的报道不多，这是因为所用的检测器多为紫外检测器（UV），而尿素的最大吸收波长在203 nm，在此波长下，很多物质都有吸收，从而造成尿素的检测灵敏度不够，检测限很高。1990年，Fujinawa等［28］开发了离子对色谱结合荧光检测器测定葡萄酒中的尿素，其原理是利用固定化脲酶分解尿素产生氨，氨与OPA衍生化后生成产荧光化合物，经离子对色谱分离后可用荧光检测器（FLD）检测。该方法灵敏度高，但样品前处理繁琐，需经过过滤、脱醇、离子交换、C18预柱除杂等步骤。1995年，Kodama等［29］优化了该方法，显著地减少了分析时间，降低了尿素的检出限。同年，Matsudo等［30］在酸性条件下，将尿素与二乙酰一肟、安替比林和氯化铁在120℃下反应，反应产物经凝胶柱分离后，在波长466 nm处进行检测，间接测定了尿素含量。此方法借鉴了二乙酰一肟与尿素的反应原理，样品制备相对比较简单，但该法灵敏度太低，且其他氨酰化合物会对结果造成严重干扰。

近年来，有研究者开发了新的HPLC-FLD方法来检测发酵酒中的尿素含量［31-32］。其原理为酸性条件下，9-羟基吨与尿素反应可生成吨基脲（如图2），吨基脲受特定波长激发光照射后，可发射出特定波长的发射光，通过测定衍生物的发射光强度即可对样品中的尿素进行定量。事实上，9-羟基吨可与很多氨酰化合物发生反应，而很多反应产物都可发出荧光。根据此原理，本课题组［33］在近期开发了一种可以同时检测发酵酒中尿素和氨基甲酸乙酯的方法，在发酵酒中尿素和氨基甲酸乙酯的检测中得到了很好的应用。

1.4其他方法

除了以上方法外，杨珩等［34］还开发了一种简单、快速的试纸条定性、半定量的尿素测定方法，此法操作简单，但只能对尿素进行定性，不能应用于实际测量。近年来，也有用近红外光谱法［35］和质谱法［36］来分析尿素含量的报道，这两种方法最显著的优势是分析操作简单、快速，但设备价格昂贵，在很多工厂和实验室不能实现。

图2反应示意图Fig.2　The schematic diagram of the derivative reaction

2　发酵酒中尿素检测的发展方向

综上所述，发酵酒中尿素的检测方法很多，但每种方法都有各自的缺点，比如分光光度法显色试剂的不稳定性，反应中有其他成分的干扰；酶催化水解法中，样品制备繁琐，样品中其他氨类物质和大气中的CO2同样会干扰测定结果；色谱分离法对设备要求高等等。因此对以上方法有针对性地改进是尿素检测重要的发展方向，如：分光光度法可以结合顺序标准注射分析，酶催化法时可以结合在线固相萃取流动注射分析，色谱分离法分析设备的改进等，也可以通过自动化程序的协助来缩短分析时间［37-38］。在实际应用中，需综合考虑尿素不同检测方法的特点及适用性，发挥不同方法的优势，满足不同的分析要求。

［1］Uthurry C A，Suárez Lepe J A.Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine［J］.FoodChemistry，2006，94（2）：262-270

［2］赵光鳌，刘洁泉.酒中致癌物氨基甲酸乙酷的研究［J］.食品与发酵工业，1988（5）：70-72

［3］高年发，宝菊花.氨基甲酸乙酯的研究进展［J］.中国酿造，2006，162（9）：1-4

［4］Francis P S，Lewis S W，Lim K F.Analytical methodology for the determination ofurea：current practice and future trends［J］.Trac trends in analytical chemistry，2002，21（5）：389-400

［5］Lambert D F，Sherwood J E，Francis P S.The determination of urea in soil extracts and related samples-a review［J］.Australian Journal of Soil Research，2004，42（7）：709-717

［6］Revilla M，Alexander J，Glibert PM.Urea analysis in coastal waters：Comparison of enzymatic and direct methods［J］.Limnology and O-ceanography：Methods，2005，3（7）：290-299

［7］FrancisPS.Thedeterminationofureainwine-areview［J］.Australian Journal of Grape and Wine Research，2006，12（2）：97-106

［8］Fearon WR.The carbamide biacetyl reaction：a test for citrulline［J］. Biochemical Journal，1939，33（6）：902-907

［9］Taylor A J，Vadgama P.Analytical reviews in clinical biochemistry：the estimation of urea［J］.Annals of Clinical Biochemistry，1992，29 （3）：245-264

［10］Douglas L A，Bremner J M.Colorimetric determination of microgram quantities of urea［J］.Analytical Letters，1970，3（2）：79-87

［11］Hasnip S，Caputi A，Crews C，et al.Effects of storage time and temperature on the concentration of ethyl carbamate and its precursors in wine［J］.FoodAdditivesandContaminants，2004，21（12）：1155-1161

［12］陈宜宜，张文悦.黄酒中尿素的检测［J］.环境污染与防治，1996，18 （3）：34-36

［13］梁新红，杨大光，孙俊良，等.分光光度法测定葡萄酒中尿素含量［J］.食品工业科技，2012，33（4）：76-79

［14］Almy J，Ough C S.Urea analysis for wines［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1989，37（4）：968-970

［15］Nagel C W，Weller K M.Colorimetric determination of urea in wine ［J］.AmericanJournalofEnologyandViticulture，1989，40（2）：143-144

［16］Monteiro F F，Bisson L F.Amino acid utilization and urea formation duringvinificationfermentations［J］.AmericanJournal of Enology and Viticulture，1991，42（3）：199-208

［17］Daudt C E，Ough C S，Stevens D，et al.Investigations into ethyl carbamate，n-propyl carbamate，and urea in fortified wines［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1992，43（4）：318-322

［18］Iida Y，Ikeda M，Aoto M，et al.Fluorometric determination of urea in alcoholic beverages by using an acid urease column-FIA system［J］. Talanta，2004，64（5）：1278-1282

［19］Mauricio J C，Valero E，Millán C，et al.Changes in nitrogen compounds in must and wine during fermentation and biological aging by flor yeasts［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49（7）：3310-3315

［20］Valero E，Millán M C，Ortega J M，et al.Concentration of amino acids in wine after the end of fermentation by Saccharomyces cerevisiaestrains［J］.JournaloftheScienceofFoodandAgriculture，2003，83（8）：830-835

［21］Fujinawa S，Burns G，De la Teja P.Application of acid urease to reduction of urea in commercial wines［J］.American Journal of Enology and Viticulture，1990，41（4）：350-354

［22］Satoh I，Akahane M，Matsumoto K.Analytical application of immobilized acid urease for urea in flow streams［J］.Sensors and Actuators，B：Chemical，1991，5（1/4）：241-243

［23］Iida Y，Koga A，Hara N，et al.Flow injection analysis of trace urea in alcoholic beverages with an acid urease column［J］.Journal of Flow Injection Analysis，2002，19（2）：133-136

［24］Iida Y，Hara N，Matsumoto K，et al.Spectrophotometric microdetermination of urea in a rice wine by using an immobilized acid urease column FIA system［J］.IEEJ Transactions on Sensors and Micromachines，2003，123（8）：306-312

［25］Iida Y，Suganuma Y，Satoh I.Fluorometric determination of urea in alcoholic beverages by using an acid urease column-FIA system［J］. Talanta，2005，64（5）：78-82

［26］Iida Y，Chiba Y，Satoh I.Development of enzyme sensors based on the gas permeation with use of follow fiber membrane［J］.Desalination and water treatment，2010，17（1/3）：19-24

［27］Iida Y，Suganuma Y，Matsumoto K，et al.Novel determination system for urea in alcoholic beverages by using an FIA system with an acid urease column［J］.Analytical Sciences，2006，22（1）：173-176

［28］Fujinawa S，Todoroki H，Ohashi N，et al.Application of an acid urease to wine：Determination of trace urea in wine［J］.Journal of Food Science，1990，55（4）：1018-1022，1038

［29］Kodama S，Suzuki T.Highly sensitive method for urea detection in wine［J］.Journal of Food Science，1995，60（5）：1097-1099，1109

［30］Matsudo T，Sasaki M.Determination of urea and citrulline in fermented foods and beverages［J］.Bioscience，Biotechnology and Biochemistry，1995，59（5）：827-830

［31］Clarks S，Francis P S，Conlan X A，et al.Determination of urea using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection after automated derivatisation with xanthydrol［J］.Journal of Chromatography A，2007，1161（1/2）：207-213

［32］Wang R Y，Wu H M，Zhou X P，et al.Simultaneous detection of ethyl carbamate and urea in Chinese yellow rice wine by HPLC-FLD［J］. Journal of liquid chromatography&related technologies，2014，37 （1）：39-47

［33］Zhang J，Liu G X，Zhang Y，et al.Simultaneous determination of Ethyl carbamate and Urea in Alcoholic beverages by HPLC-FLD ［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2014，62（13）：2797-2802

［34］扬珩，晃玉生.食品及饲料中尿素快速检测法［J］.黑龙江日化，1997（3）：41-42

［35］González-Martín I，Hernández-Hierro J M.Detection and quantification of additives（urea，biuret and poultry litter）in alfalfas by NIR spectroscopy with fibre-opric probe［J］.Talanta，2008，76（5）：1130-1135

［36］Bowen C L，Licea-Perez H.Development of a sensitive and selective LC-MS/MS method for the determination of urea in human epithelial lining fluid［J］.Journal of Chromatography B，2013，917-918：24-29

［37］Legnerová Z，Šatíský D，Solich P.Using on-line solid phase extraction for simultaneous determination of ascorbic acid and rutin trihydrate by sequential injection analysis［J］.Analytica Chimica Acta，2003，497（1）：165-174

［38］Economou A.Sequential-injection analysis（SIA）：a useful tool for on-line sample-handling and pre-treatment［J］.Trends in Analytical Chemistry，2005，24（5）：416-425

The Determination of Urea in Fermented Liquors

ZHANG Ying1，LIU Guo-xin2，HU Cui-cui2，ZHANG Jian2，*
（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

This article reviewed the principle of the colorimetry，enzyme and chromatography for urea detection in fermented liquors，and summarzed the advantages and disadvantages，as well as the applied conditions of these methods，in the end，proposed the tendency for urea detection.

urea；fermented liquors；ethyl carbamate；detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.050

国家自然科学基金资助项目（31101275；31201354）

张颖（1978—），女（汉），高级实验师，硕士，主要从事食品安全方面的研究。
*

2015-12-14