普拉康唑中四种光学异构体的HPLC法测定

郑曦孜

重庆涵虚阁制药技术开发有限公司研发部，重庆　400064

普拉康唑中四种光学异构体的HPLC法测定

郑曦孜

重庆涵虚阁制药技术开发有限公司研发部，重庆400064

目的建立同时测定普拉康唑中4种光学异构体含量的方法。方法采用高效液相色谱法对普拉康唑中4种光学异构体的含量进行测定。色谱柱为Daice1 Chira1pak IC手性柱；流动相为正己烷∶乙醇（80∶20），流速为1.0 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为25℃。结果 4种光学异构体间分离度均大于1.5，检测质量浓度线性范围均为0.5～120 μg/mL（r≥0.9992），方法回收率≥99.75%，RSD＜1.50%（n=3），检测限为0.15 μg/mL，3批普拉康唑样品中异构体的含量分别为批号151001：99.90%、0.02%、0.04%、0.04%；批号151002：99.89%、0.03%、0.05%、0.03%；批号151003：99.87%、0.02%、0.05%、0.06%。结论建立的方法准确、快速，实现了对普拉康唑光学异构体杂质的有效控制。

普拉康唑；光学异构体；含量测定；高效液相色谱法

［Abstract］Objective To estab1ish the method for determination of 4 kinds of enantiomers in Pramiconazo1e.Methods HPLC method was adopted to determine the content of 4 kinds of enantiomers in Pramiconazo1e.The determination was separated on Daice1 Chira1pak IC.The mobi1e phase was consisted of hexane-ethano1（80∶20）at a f1ow rate of 1.0 mL/ min and the co1umn temperature at 25℃.The detection wave1ength was 210 nm.Results The reso1ution of 4 kinds of enantiomers were greater than 1.5.The 1inear range of them were 0.5-120 μg/mL（r≥0.9992，n=8）with an recovery rate≥99.75%（RSD＜1.50%，n=3）.The detection 1imits was 0.15 μg/mL.The enantiomer content of Pramiconazo1e was batch No.151001∶99.90%，0.02%，0.04%，0.04%；batch No.151002∶99.89%，0.03%，0.05%，0.03%；batch No.151003∶99.87%，0.02%，0.05%，0.06%.Conclusion The method is accurate，rapid and suitab1e for qua1ity contro1 of enantiomers in Pramiconazo1e.

［Key words］Pramiconazo1e；Enantiomers；Content determination；HPLC method

普拉康唑（Pramiconazo1e，A），化学名为1-（4-｛4-［4-（｛（2S，4R）-4-（2，4-二氟苯基）-4-［（1H-1，2，4-三唑-1-基）甲基］-1，3-二氧戊环-2-基｝甲氧基）苯基］哌嗪-1-基｝苯基）-3-（丙烷-2-基）咪唑烷酮-2-烷，是由比利时Barrier Therapeutics公司开发研制的一种新型三唑类抗真菌药，目前在欧盟尚处于Ⅱa期临床试验阶段，尚未上市，具有疗效确切，耐受性好，不良反应程度较轻的特点，是一种较有发展前途的广谱抗真菌药。该药的抗菌机制除了抑制麦角固醇合成，还涉及到降低马拉色菌对角质细胞的黏附及与机体固有兔疫的协同作用。普拉康唑在抗念珠菌和马拉色菌方面具有比较明显的优势，在相同剂量下表现出较伊曲康唑更强的抗菌能力。该药的前体分子是伊曲康唑，两者都对表皮癣菌、酵母菌和其他许多真菌有明显的抗菌作用。普拉康唑作为口服药物用于治疗浅部真菌感染，如皮肤、甲、口腔外阴黏膜疗效明显，不良反应少且程度轻。不足之处是临床应用范围不如伊曲康唑广，目前仅用于治疗浅部真菌感染［1-19］。

普拉康唑结构中有2个手性碳，在合成过程中可能会产生4种光学异构体，除了目标化合物普拉康唑A外，还有（2R，4S）-构型的B、（2R，4R）-构型的C和（2S，4S）-构型的D。化学结构见图1。按照研发立体异构体新药的相关技术要求［20］，有必要建立一套完善的分析方法对普拉康唑的光学异构体杂质进行质量控制和产品质量评价。由于普拉康唑还未上市，分析方法尚未公开，为此，本研究根据《中国药典》2015年版二部附录VD的相关要求［21］，建立了一套HPLC法来监控4种光学异构体。该色谱条件满足对普拉康唑光学异构体的分离要求，方法准确、快速，重现性好，可为普拉康唑原料药及制剂质量分析等工作提供依据。

图1　普拉康唑A化学结构

1仪器与试药

1　仪器与试药

1260型高效液相色谱仪（美国安捷伦）。对照品A（含量99.94%，批号151101）、B（含量97.45%，批号151102）、C（含量96.35%，批号151103）和 D（含量96.21%，批号151104），均为重庆涵虚阁制药技术开发有限公司（以下简称“本公司”）合成、精制、标定（以峰面积归一化法计主峰纯度）；普拉康唑样品（本公司自制，批号151001、151002、151003）；正己烷、乙醇均为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2　方法与结果

2.1溶液配制

对照品溶液：分别精密称取普拉康唑对照品A～D各约10 mg，各置于100 mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为浓度为100 μg/mL的对照品溶液。

混合对照品溶液：将4种异构体对照品溶液按1∶1∶1∶1的比例混合，作为浓度为25 μg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：精密称取普拉康唑样品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇匀，作为浓度为1 mg/mL的供试品溶液。

2.2色谱条件

分别将A～D对照品溶液在190～400 nm进行扫描，各异构体均在210 nm处有较强吸收，故选定检测波长为210 nm。色谱柱Daice1 Chira1pak IC手性柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相正己烷∶乙醇 （80∶20）；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm；柱温25℃；进样量10 μL。

2.3系统适用性试验

取普拉康唑A～D对照品溶液及其混合对照品溶液，分别进样测定，结果表明，A～D的保留时间分别为8.18、11.15、7.78、9.12 min，普拉康唑及其光学异构体基线达到完全分离，理论板数均大于10 000，分离度分别为1.72、2.96、5.92，拖尾因子均小于1.15，溶剂峰不干扰测定。色谱图见图2。

图2　HPLC图谱

2.4线性试验

分别精密称取A～D异构体对照品适量，加流动相溶解并摇匀稀释，配制成约0.5、5、10、20、50、80、100、120 μg/mL的系列浓度溶液，进样测定，以峰面积A对浓度C作图，进行线性回归，分别得到异构体A、异构体B、异构体C和异构体D的回归方程，结果见表1。A～D均在0.5～120 μg/mL浓度范围内线性关系良好，最低检测限（LLOD）为0.15 μg/mL，最低定量限（LLOQ）为0.5 μg/mL。

表1　线性试验结果

2.5回收率试验

按“2.1”项下方法，精密称取已知4种异构体含量的供试品各9份，分别加入含4种异构体为高、中、低3个质量浓度的对照品溶液各3份，作为回收率试验溶液，依法分析，计算回收率。普拉康唑4种异构体A、B、C、D的回收率。结果RSD均小于1.5%，表明本方法回收率良好。见表2。

表2　回收率试验结果（%，n=3）

2.6精密度和稳定性试验

取“2.1”项下的混合对照品溶液和供试品溶液，分别连续进样6次，记录色谱图。结果RSD均小于2.0%（n=6），表明本方法精密度良好。

分别取上述混合对照品溶液和供试品溶液，于室温放置，分别于0、2、4、6、8 h进样测定，记录色谱图。结果A～D的峰面积在8 h内的RSD均小于2.0%（n= 5），表明混合对照品溶液室温放置8 h稳定。

2.7耐用性实验

分别采用不同实验人员，不同温度，不同比例的流动相进行测定，分离效果均符合要求，分离度大于1.5，可以用于普拉康唑光学异构体的分离测定。

2.8样品测定

取样品适量，按“2.1”项下方法制备对照品溶液和供试品溶液，分别进样测定，记录色谱图。供试品溶液色谱图中如有与各异构体保留时间相同的杂质峰，按外标法以峰面积计算各异构体的含量。见表3。

表3　三批普拉康唑样品中异构体含量测定结果（%）

3　讨论

3.1色谱柱的选择

本研究在色谱条件摸索试验中先后测试了不同的手性色谱柱，包括蛋白质型、手性多聚物型、5 μm硅胶表面共价键合纤维素-三（3，5-二氯苯基氨基）甲酸酯型（Daice1 Chira1pak IC）等。结果表明，蛋白质型手性色谱柱对4种光学异构体难以实现基线分离，分离度小于1；手性多聚物型色谱柱可以满足基线分离4种光学异构体，但是如果异构体A和C分离度要大于1.5以上，则异构体B的出峰时间将超过50 min，且峰形较宽，不能快速、准确地进行定量测定；而Daice1 Chira1pak IC手性色谱柱分离，普拉康唑4种光学异构体的分离度均大于1.5，4种手性异构体色谱峰的拖尾因子均小于1.15。出峰时间在15 min以内，所以最终选择Daice1 Chira1pak IC手性色谱柱测定普拉康唑4种光学异构体。

3.2流动相的选择

以Daice1 Chira1pak IC手性色谱柱，先后筛选了正己烷-乙醇和正己烷-异丙醇系统。结果表明，使用正己烷-乙醇系统时，色谱峰形较差，拖尾严重；正己烷-异丙醇系统则可以实现良好的分离。通过调整一系列不同比例的正己烷-异丙醇流动相，最终选择以正己烷-异丙醇（80∶20）为流动相，可以显著地提高分离度和理论塔板数，优化色谱峰的柱效、分离度及出峰时间。

3.3流速及柱温的选择

本研究还考察了仪器的流速及柱温对异构体分离度的影响，结果表明，改变流速和柱温对异构体的分离影响较小，综合考虑，选择流速为1.0 mL/min，柱温25℃，试验表明此条件下普拉康唑4种异构体能在较短的时间内达到基线分离，符合测定要求。

综上所述，本研究先后测试了不同的手性色谱柱、不同的流动相系统对普拉康唑4种光学异构体进行了色谱条件的摸索与验证，确定了同时准确、快速测定4种光学异构体含量的HPLC方法。本研究成功地将3个光学异构体与普拉康唑进行较好地分离。通过验证试验证明该方法分离度好、精密度高，各异构体在此条件下呈良好线性，可以用于普拉康唑异构体的检测与质量控制。

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Determination of four Enantiomers in Pramiconazole by HPLC method

ZHENG Xizi
Department of R&D，Chongqing Hanxuge Pharmaceutica1 Co.Ltd.，Chongqing400064，China

R927.2

A

1673-7210（2016）04（c）-0143-04

郑曦孜（1976-），男，硕士，主要从事新药质量研究。

2016-01-15本文编辑：赵鲁枫）