应激性胃溃疡大鼠前爪不同区域黑色素变化的ghrelin-POMC通路研究

秦培洁　　王柳青　　程志立　　狄　颖　　刻剑锋

中国中医科学院中国医史文献研究所，北京　100700

应激性胃溃疡大鼠前爪不同区域黑色素变化的ghrelin-POMC通路研究

秦培洁王柳青程志立狄颖刻剑锋▲

中国中医科学院中国医史文献研究所，北京100700

目的探讨应激性胃溃疡大鼠前爪手掌不同区域黑色素变化及其机制。 方法采用随机数字表法将20只SD雄性大鼠分为空白对照组、模型组，每组各10只，利用无水乙醇灌胃复制应激性胃溃疡模型后，利用多巴氧化酶检测两组大鼠前爪皮肤黑色素变化；用ELISA法检测两组大鼠血清ghre1in水平；用RT-PCR法检测两组大鼠胃黏膜组织ghre1in mRNA、垂体和前爪皮肤组织POMC mRNA水平。结果模型组大鼠5区的黑色素细胞明显增多；与空白对照大鼠比较，模型组大鼠的血清ghre1in水平及ghre1in mRNA降低，且差异有统计学差异（P＜0.05）；模型组大鼠的垂体和前爪皮肤组织POMC mRNA水平显著高于空白对照组（P＜0.05）。结论应激性胃溃疡大鼠的病理变化可以在手掌特定区域通过黑色素的变化反映出来，初步推测其内在机制可能是通过作用于ghre1in-POMC通路实现的。

手诊；大鼠前爪；黑色素含量；脑肠肽；阿黑皮素原

［Abstract］Objective To investigate the change and the mechanism of me1anin in forepaw skin of rats with irritab1e u1cer.Methods 20 rats were divided into two groups by random number tab1e∶b1ank contro1 group and mode1 group，each group had 10 rats.Acute gastric mucosa1 injury mode1 was estab1ished by intragastric administration of 75% ethano1.The me1anin 1eve1s of forepaw skin in the two groups were detected by dopa oxidase.Serum ghre1in 1eve1s in the two groups were detected by ELISA method.Ghre1in mRNA of Gastric mucous tissue，POMC mRNA of pituitary and forepaw skin tissues were detected by RT-PCR method.Results The me1anin in 5-zone were significant1y increased in the mode1 group.Compared with the b1ank contro1 group，the ghre1in 1eve1 and ghre1in mRNA in the mode1 group significant1y decreased（P＜0.05）.The POMC mRNA 1eve1s in the pituitary and forepaw skin tissues of the mode1 group were significant1y higher than those in the b1ank contro1 group（P＜0.05）.Conclusion The patho1ogica1 changes of rats with irritab1e u1cer can be ref1ected by me1anin in particu1ar area of forepaw，pre1iminary specu1ation that the interna1 mechanism may be rea1ized by ghre1in-POMC pathway.

［Key words］Hand diagnosis；Rat forepaw；Me1anin content；Ghre1in；POMC

气色形态手诊是由刘剑锋教授首次提出的创新中医诊断方法，是在中医望色诊病理论基础上结合临床实践建立起来的。在经过多年临床实证的基础上，近年来课题组致力于寻找气色形态手诊的机制，以期为中医“司内揣外”理论提供研究方法和实验依据。在前期的工作中，课题组发现急性胃损伤大鼠的前爪特定部位皮肤黑色素细胞增多，本研究在前期研究基础上探讨其内在机制。

1　材料与方法

1.1实验动物

SD雄性大鼠20只，周龄为8周，体重为（250± 10）g，由中国军事医学科学院提供，批号：0019089。

1.2主要试剂

75%乙醇（上海利康消毒高科技有限公司），甲醛溶液、10 mg/mL溴化己锭、硫酸铝（Sigma公司），血清脑肠肽（ghre1in）检测ELISA试剂盒（Ad1itteram Diagnostic Laboratories公司），Trizo1试剂、逆转录试剂盒、PCR试剂、Taq DNA聚合酶和DNA Marker（美国Fer-mentas公司），琼脂糖凝胶（英国OXOID公司），多巴胺氧化酶DopA（Cayman公司），磷酸氢二钠（Biotopped公司），磷酸氢二钾（福晨化学）。

1.3实验方法

1.3.1动物分组

20只SD雄性大鼠适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为空白对照组和应激性胃溃疡模型组（模型组），各10只。

1.3.2模型建立

模型组：大鼠腹腔注射0.9%NaC1溶液2 mL/kg，1 h后以1 mL/100 g 75%乙醇灌胃诱导急性胃黏膜损伤模型；空白对照组：腹腔注射0.9%NaC1溶液2 mL/kg。1.3.3观察指标

1.3.3.1形态学观察肉眼观察两组大鼠的胃大体标本。

1.3.3.2胃溃疡指数大鼠胃组织用4%甲醛溶液固定，然后沿胃大弯剪开，显微镜下观察出血性病灶，采用测微尺计算胃黏膜损伤面积。计分标准：0分：正常胃黏膜；1分：点状损伤；2分：病损＜1 mm；3分：病损1～＜2 mm；4分：病损2～＜3 mm，以此类推，胃溃疡指数=全胃评分的总和［1］。

1.3.3.3组织病理学检查 取大鼠胃窦部组织，石蜡切片，行HE染色，光学显微镜下观察大鼠胃壁4层结构是否清晰、胃黏膜表面是否光滑、上皮是否完整、腺体排列是否整齐。

1.3.4大鼠前爪特定部位黑色素变化测定方法［2-5］

1.3.4.1试剂配制 0.0056 mo1/L DopA液的配制：称取DopA 1.10 g，溶解于1000 mL蒸馏水。0.1 mo1/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）配制：A液为0.1 mo1/L磷酸氢二钠35.8 g溶解于1000 mL蒸馏水；B液为磷酸二氢钾13.6 g溶解于1000 mL蒸馏水；取A液9份与B液1份混合，pH调至7.4。孵育液配制法：0.1 mo1/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4）溶入0.0056 mo1/L的DopA内。将配制好的孵育液保存于冰箱内备用。

1.3.4.2操作步骤 取大鼠5区［6］皮肤作为标本（图1），用10%甲醛固定组织1 h（22℃）或4～8 h（4℃），修切已固定的组织块，厚3～5 mm，流水冲洗3 min，组织块浸于孵育液中1 h（37℃），流水冲洗2～6 h，在Bouin液中重新固定24 h。各级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度8 μm，用5%硫酸铝水溶液配制的0.1%核固红复染10 min，流水冲洗片刻至核深红色、胞质带红色为止。最后脱水、透明，中性树胶封片。

图1 大鼠前爪分区

1.3.5大鼠血清脑肠肽水平

应用ELISA方法测定各组动物血清中脑肠肽（ghre1in）水平。检测方法按试剂盒说明书的操作步骤进行。

1.3.6大鼠胃组织ghrelin mRNA和垂体、前爪皮肤组织POMC mRNA表达

按Trizo1试剂盒所示方法提取总RNA，检查其浓度和纯度后，在PCR热循环仪中逆转录为cDNA。PCR反应程序为94℃预变性25 s，退火30 s，60℃延伸30 s，共35个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。引物序列见表1。凝胶扫描分析仪计算目的条带吸光度值，目的基因mRNA表达的相对强度=目的基因条带灰度值/内参照条带灰度值。

表1　ghrelin和POMC引物序列

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1肉眼形态学观察

空白对照组大鼠胃表面较为光滑，胃黏膜完好，色淡红，覆盖有大量黏液，无溃疡、糜烂及出血现象；模型组大鼠胃表面有白色覆盖物，呈红色及黑褐色条索状，有点状出血点，溃疡灶表现明显，有胃出血现象，部分溃疡穿孔。见图2，封三。

2.2光学显微镜下观察

光学显微镜下观察显示，空白对照组胃黏膜各层光整完好，无炎症细胞浸润，胃黏膜完整，胃小凹结构和黏膜腺体排列整齐；模型组部分胃黏膜中断，溃疡可深及肌层，有炎症细胞浸润，胃黏膜不完整，肌层变薄部分断裂，纤维蛋白坏死，浆膜层部分断裂。

2.3胃溃疡指数

空白对照组无胃溃疡，模型组的胃溃疡指数为（79.19±11.18），与空白对照组比较，胃溃疡指数显著升高（P＜0.01），提示造模成功。

2.4大鼠前爪特定部位黑色素变化

与空白对照组比较，模型组大鼠前爪特定部位黑色素细胞增多。见图3（箭头所示）。

图3　大鼠前爪皮肤黑色素细胞分布

2.5大鼠血清ghrelin水平

相较于对照组［（159.23±15.17）ng/L］，模型组血清ghre1in水平［（94.23±11.02）ng/L］明显降低，且差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.6大鼠胃组织ghrelin mRNA和垂体、前爪皮肤组织POMC mRNA表达

模型组大鼠胃组织ghre1in mRNA表达水平明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组大鼠垂体和前爪皮肤组织POMC mRNA表达水平明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2　两组大鼠胃组织ghrelin mRNA和垂体、前爪皮肤组织POMC mRNA表达比较（±s）

表2　两组大鼠胃组织ghrelin mRNA和垂体、前爪皮肤组织POMC mRNA表达比较（±s）

注：ghre1in：脑肠肽；POMC：阿黑皮素原

组别　　只数　ghre1in mRNA　POMC mRNA垂体　　前爪空白对照组模型组P值10 9 1.25±0.79 0.91±1.01 0.032 0.35±0.29 0.51±0.92 0.041 0.21±0.68 0.39±1.71 0.021

3　讨论

气色形态手诊已在临床实践中得到了大量的验证和推广［7］。在气色形态手诊理论中，胃区位于手掌的正中心，呈正圆形，向左不超过生命线，向右不超过无名指竖直平分线，而在病理状态下，该区的气色形态将发生一定的改变［8］。

传统观点认为，引起交感神经兴奋和下丘脑垂体肾上腺功能反应是胃损伤应激效应的机制，其中起关键作用的是促皮质激素释放因子，该因子由下丘脑释放，即四十一肽酰胺的中枢效应所致［9］。近年的研究发现，应激期间ghre1in作为中枢的某些神经肽也参与了应激过程的调控［10-12］。ghre1in具有调节胃酸分秘、胃肠运动和能量代谢等功能，主要由胃黏膜的A/X细胞产生［13］。同时ghre1in样兔疫活性细胞也分布于中枢神经系统［14-16］。

POMC是一种29 kD的蛋白质，可以在垂体前部释放对黑色素生成有重要作用的α-MSH。这种作用是通过与黑素细胞内相应受体（MCIR）结合来实现的。结合后，细胞内cAMP的含量增加，酪氨酸酶活性增强，进而刺激黑色素细胞分化、增殖，促进黑色素的生物合成。ghre1in通过旁分泌、自分泌和内分泌作用来调节胃肠道和中枢。这种调节作用不是孤立的，而是受到中枢前POMC的影响［17］。Ho1m等［18］第一次证明了ghre1in受体的变化的与下丘脑POMC mRNA表达的变化有关。

本实验发现，急性胃黏膜损伤大鼠的前爪5区（胃区）黑色素增加，而与黑色素形成息息相关的POMC mRNA在前爪皮肤组织表达也增加，胃组织的ghre1in mRNA、垂体的POMC mRNA也发生变化。一方面验证了ghre1in的表达受POMC的影响，另一方面提示前爪5区黑色素的变化可能与POMC、ghre1in的变化有关，具体明确关系有待进一步的研究去发现、证实。

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Research on the ghrelin-POMC pathway of blood melanin change in different areas of forepaw in rats with irritable ulcer

QIN PeijieWANG LiuqingCHENG Zhili DI YingLIU Jianfeng▲
Institute of Chinese Medica1 History Literature，China Academy of Chinese Medica1 Sciences，Beijing100700，China

R573.1

A

1673-7210（2016）04（c）-0012-04

国家自然科学基金资助项目（81173197）▲

2016-01-24本文编辑：程铭）