复方贞术调脂胶囊对糖皮质激素诱导骨质疏松大鼠股骨和腰椎骨密度及生物力学特性的研究

孙平 胡伶平 董群伟 蔡妹群 王晓东 郭姣 刘忠厚

1. 广东药学院附属第一医院骨质疏松基地，广东 广州 510006 2. 广东药学院附属第一医院骨科, 广东 广州 510006 3. 国家中医药管理局高脂血症调肝降脂重点研究室, 广东药学院国家中医药管理局脂代谢三级实验室, 广东 广州 510006 4. 中国老年学学会骨质疏松委员会, 北京 100102

糖皮质激素因具有强大的抗炎、抗免疫和抗休克作用，被广泛应用于器官移植、自身免疫疾病、炎症及肿瘤治疗等领域。但其导致的主要副作用之一——糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)，已成为普遍存在的临床问题，GIOP是医源性骨质疏松的最常见原因，其发生率仅次于绝经后骨质疏松症及老年性骨质疏松症而位居第3位[1]。有报道指出，糖皮质激素首先是引起脂质代谢紊乱，其次引起骨量减少，如近年来发现他汀类药物在抗骨质疏松的治疗中起到积极作用[2,3]，但对肝脏、肾脏等副作用较明显。基于此，本研究选用我校自主创新研发的具有护肝调脂作用的复方贞术调脂胶囊(FTZ)，通过改善脂代谢紊乱，以期对GIOP的防治起到有益作用。

1 材料和方法

1.1 动物模型和实验分组

3月龄SPF级雄性SD大鼠32只，体质量(210±15)g，购于南方医科大学实验动物中心。适应喂养7 d后，随机平均分为4组：Nrm组为正常对照组，Met组为皮下注射甲强龙(Met)5 mg/(kg·d)，每周5次[4]，低剂量组(FTZL)和高剂量组(FTZH) 分别在Met组基础上每天给予FTZ 1.5 g/kg和FTZ 6g/kg灌胃[5]，4组大鼠均单笼喂养，自由进食和饮用纯净水，实验期12w。实验期满后用3.3%浓度的水合氯醛溶液(10mL/kg)麻醉，左心室放血处死大鼠。双侧股骨及第4，5腰椎(L4, L5)，剔除附着的软组织，用浸湿生理盐水的纱布包裹，置于置于-20 ℃的冰箱内保存备骨生物力学和骨密度测定(1w内测定)。

1.2 生物力学测定

1.2.1三点弯曲试验：将剔除软组织的右侧股骨，置于生物力学试验机(MTS-858型, 美国)上，支点跨距17 mm，加压点为中点，加载速度2 mm/min，加载至骨折，计算机记录载荷-位移曲线，根据载荷-位移曲线计算最大载荷、刚度和弹性模量。股骨中点所在截面近似地认为呈椭圆形，数字游标卡尺(精密度0.02 mm)测量其内、外径，计算骨宏观几何参数。

1.2.2压缩试验：去除L4椎弓及附件单留椎体，砂纸打磨椎体上下表面，使之成为相互平行的平面，数字游标卡尺(精密度0.02mm)测量椎体高度，根据阿基米德定律计算椎体横断面的面积。将标本置于生物力学试验机(同上)上，下表面紧贴于不锈钢板上，加载的方向与不锈钢的表面垂直，行压缩试验，加速度为2 mm/min，计算机记录载荷-位移曲线。根据载荷-变形曲线计算椎体的最大载荷和刚度。

1.3 股骨和L5骨密度测定

将左侧股骨及L5置于QDR4500A型双能X线骨密度测定仪上，计算机采用小动物梯级标准分析软件，自动记录股骨和L5骨密度。扫描速度10 mm/s，扫描间距0.5 mm× 0.5 mm。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 FTZ对大鼠骨生物力学参数的作用

实验期满后，Met组大鼠L4和股骨的最大载荷、刚度、弹性模量显著低于Nrm组相应指标(P<0.001,P<0.01)；FTZL组大鼠最大载荷、刚度、弹性模量较Met组有升高趋势，但两组间各指标均无显著性差异(P>0.05)；FTZH组大鼠L4和股骨的最大载荷、刚度、弹性模量显著高于Met组相应指标(P<0.01,P<0.05)，且L4的最大载荷FTZH组显著高于FTZL组(P<0.05)，L4的刚度、弹性模量和股骨的最大载荷、刚度、弹性模量FTZH组较FTZL组有增加趋势，但两组间各指标均无显著性差异(P>0.05) (见表1, 2)。

表1 各组大鼠股骨(右)三点弯曲试验的结果Table 1 Tri-point bending parameters of the rat femur (right) in different

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001, vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL

表2 各组大鼠L4压缩试验几何及力学参数的结果Table 2 Compression and geometrical parameters of

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001 vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL.

2.2 FTZ对大鼠股骨和腰椎中段截面几何参数的变化

Met组大鼠椎体横断面面积、股骨中段截面面积和皮质骨厚度显著低于Nrm组(P<0.001,P<0.01)，股骨骨髓腔面积显著高于Nrm组(P<0.01)；FTZL组大鼠椎体横断面面积、股骨中段截面面积和皮质骨厚度高于Met组，股骨骨髓腔面积低于Met组，但各指标间均无显著性差异(P>0.05)；FTZH组大鼠椎体横断面面积和皮质骨厚度显著高于Met组(P<0.05)，股骨髓腔面积显著低于Met组(P<0.05)，股骨中段截面面积较Met组有增加趋势，但无显著性差异(P>0.05)， FTZH组椎体横断面面积、股骨中段截面面积和皮质骨厚度较FTZL组有增加趋势，股骨骨髓腔面积低于FTZL组，但各指标间均无显著性差异(P>0.05) (见表2, 3)。

表3 各组大鼠股骨中段截面几何参数的结果Table 3 Geometrical parameters of the middle femur section

注：*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001, vs Nrm；#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001 vs Met；▲P< 0.05 vs FTZL

2.3 药物对大鼠左侧股骨和L5骨密度的作用

4组大鼠间左侧股骨和L5的骨密度均有差异(P<0.001,P<0.01,P<0.05)，Met组显著低于Nrm组(P<0.001)；FTZH组股骨和L5骨密度均高于Met组(P<0.01,P<0.05)；FTZL组L5骨密度显著高于Met组(P<0.05)，FTZH组L5骨密度显著高于FTZL组(P<0.05) (表4)。

表4 各组大鼠骨密度结果Table 4 Results of BMD in different groups

注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001, vs Nrm；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001 vs Met；▲P<0.05 vs FTZL

3 讨论

上世纪五十年代开始将糖皮质激素作为抗炎和免疫抑制药物广泛应用于慢性阻塞性肺病、哮喘、风湿免疫性疾病、炎性肠病等多种疾患及器官移植后的治疗中。长期使用糖皮质激素会导致脂质代谢紊乱、骨质疏松症及骨折危险性增加等一系列副作用，成为其临床应用的主要障碍。据统计，在接受糖皮质激素治疗的慢性疾病人群中，最终有30%～50%发展为骨质疏松[6]，有超过1/3的绝经后妇女长期(> 6个月)口服糖皮质激素治疗，椎体至少发生过1次椎体骨折[7]，且绝经后妇女长期使用糖皮质激素的患者往往同时伴有骨质疏松和脂质代谢紊乱[8,9]，有学者调查发现绝经后妇女的血浆LDL-C与股骨颈及全髋BMD呈显著负相关[10]，TC和LDL与股骨颈和腰椎BMD呈显著负相关[11]。高脂血症与骨质疏松两者在发病机制及临床治疗方面的关系已引起人们越来越多的关注。在调脂治疗中，骨质疏松常常会改善，而在抗骨质疏松治疗的过程中，脂代谢紊乱也往往会得以逆转，因此高脂血症与骨质疏松症两者在发病机制及临床治疗方面的相互关系已引起人们越来越多的关注。

对于GIOP的治疗目前仍没有理想方法，原因是由此引起的骨质疏松机制复杂。中药尤其是中药复方具有多环节，多靶点，多效应器官发挥功效的特点，其在防治脂质代谢紊乱及骨质疏松方面，有着较大的开发和应用价值。我校郭姣教授自主研发的FTZ主要以佛手、黄连、杜仲、白术、丹参等为主要成分，具有调脂、抑斑块、保护内皮等一系列作用。研究发现，FTZ能有效调节实验性动脉粥样硬化家兔的脂代谢异常，对高脂血症相关的HMG-CoA还原酶(HMGR)，肝脏X受体(LXR)，过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)等均有潜在作用[5,12,13]。同时发现该药物能够显著增加大鼠皮质骨厚度和骨小梁数目。因此本研究以调脂为基点，分别采用高、低剂量的FTZ以期观察其对GIOP大鼠的骨量和骨质量的积极作用。

BMD是诊断骨质疏松症的“金标准”，可以间接评价骨质健康情况及骨强度，能够较好地预测骨折的发生风险。DXA在评价大鼠骨质疏松模型及疗效的判定方面有很好的精确性和准确性，是一快速、可靠的技术手段。本研究发现，GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD较正常组均显著下降，与以往报道一致[4]，说明本实验采用甲强龙致大鼠骨质疏松模型建立成功。同时FTZH组能够显著增加GIOP大鼠股骨和腰椎的BMD，FTZL组仅能够显著增加腰椎BMD，且FTZH组显著高于FTZL组，提示FTZ能够有效延缓糖皮质激素诱导的大鼠骨量丢失特别是松质骨，且呈剂量依赖性。骨生物力学是全面评价骨质量最可靠的指标，是骨量、骨结构和骨强度的综合体现，在评价治疗骨质疏松药物对骨质量影响中的作用无法被其他测定方式所取代。其中三点弯曲实验主要反映皮质骨的力学特性，压缩实验主要是松质骨力学特性的体现。我们发现，GIOP大鼠股骨和腰椎的结构力学特性(最大载荷)、材料力学特性(刚度和弹性模量)均较正常组显著降低，与其BMD的下降相一致，通过给予FTZH可显著增加大鼠股骨和腰椎的结构力学特性，在股骨三点弯曲实验中，高、低剂量的FTZ两组间未见显著性差异；而在腰椎压缩实验中，FTZH组的最大载荷显著优于FTZL组，表明高剂量的FTZ对提高骨生物力学特性方面有积极作用，且呈剂量依赖性，特别是对松质骨力学特性的改善作用与BMD结果相符。骨横截面积是反映骨膜骨形成的一项可靠指标，本研究对股骨和腰椎宏观几何结构的测量数据表明，GIOP大鼠股骨和腰椎宏观几何结构的生物力学应答调节机能减弱或消失，导致股骨中段截面面积和椎体横截面积显著性降低，股骨骨髓腔面积显著增加，骨皮质厚度减少，说明大鼠骨膜骨形成受抑制，进而影响到大鼠股骨及椎体的生物力学特性，与既往研究一致[14]。通过给予高剂量FTZ干预后可显著增加大鼠股骨和腰椎的结构力学和材料力学特性，改善骨宏观几何参数，对GIOP大鼠骨膜骨形成起到积极作用，在提高骨生物力学特性，增加骨质量，降低骨折发生风险方面效果明显。

本研究结果初步表明，具有护肝调脂作用的FTZ可以延缓GIOP大鼠的骨量丢失，增加BMD，维持骨生物力学特性，提示FTZ在改善骨质量、降低骨折的发生方面有一定的积极作用。本研究只是初步观察FTZ对骨质疏松症的防治作用同时给我们提供了新的思路和方法，从改善脂质代谢紊乱为出发点或许是抗骨质疏松症治疗的另一途径，后续FTZ对骨代谢的影响及其机制方面的探讨目前正在进行中。