淫羊藿苷对人成骨样细胞成骨分化及OPG/RANKL表达的影响

张顺聪 郭丹青 李永贤 唐永超 杨志东 梁德* 李大星 莫国业 冯蓬勃

1. 广州中医药大学第一附属医院脊柱骨科，广州 510405 2. 广州中医药大学，广州 510400

目前治疗骨质疏松的药物主要作用为抑制骨吸收，但同时也会影响骨形成，甚至可能导致骨肿瘤[1]。因此为了减少骨量丢失，需要一种能够诱导成骨细胞生成的治疗方式。目前临床运用的有甲状旁腺素或新型的代谢药物如钙敏受体拮抗剂、Wnt通路抑制剂[2-3]，另外异黄酮是一种有前景的防治骨质疏松药物。淫羊藿苷是一种从中药淫羊藿中分离出的活性黄酮糖苷，临床常将淫羊藿用于治疗肾、关节及肝脏等疾病。实验表明淫羊藿苷可促进大鼠成骨骨髓间充质细胞像向成骨细胞分化，并促进成骨细胞的成熟和矿化和抑制破骨细胞生成[4]。传递成骨细胞和破骨细胞相互作用的一个重要信号通道为骨保护素(Osteoproteyerin， OPG) /核因子NF-κB 受体激活因子配体(ReceptorActivator of NF-κB Li gand, RANKL)/核因子NF-κB受体激活因子(ReceptorActivator of NF-κB, RANK)，淫羊藿苷对人成骨样细胞(MG-63)成骨分化，以及是否通过作用于OPG/RANKL影响成骨分化尚不明确。

1 材料和方法

1.1 细胞株

人骨肉瘤成骨样细胞系(购于中国典型培养物保藏中心，CCTCC编号号GDC074)。

1.2 药物

淫羊藿苷试剂(含量98%，上海纯优生物科技有限公司)，用DMEM培养基稀释并分别配制成1 nmol/ml，10 nmol/L，100 nmol/L，1 μmol/L，10 μmol/L，过滤分装后备用。

1.3 试剂及仪器

无酚红DMEM培养液；0.25%胰酶-EDTA;抗坏血酸，焦碳酸二乙酯(DEPC);TRIzol和胎牛血清(FBS,美国Gibico公司)；逆转录试剂盒(日本TAKARA公司)；引物(合成于life technology公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；OPG(Santa Cruz生物工程公司)、RANKL(Cell singnaling)、GAPDH抗体(Cell singnaling)；辣根过氢化物酶标记的抗兔二抗(Cell singnaling)。细胞培养箱(SHELLAB公司)；超净台(美国Forma Scientific公司)，高速低温离心机(Eppendorf公司5804R)；全波长多功能酶标仪(上海公司MK3)；凝胶影像分析仪(美国Bio-Rad公司Gel Doc XR+)，梯度PCR仪(美国BIO-RAD公司T100)；实时荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司CFX96 Touch)；生物显微镜(德国Leica公司DM1000)；电子天平(赛多利斯公司BSA-623S-CW)；细胞培养瓶和培养板(美国Corning Costar公司)；10%FBS的1640培养基(美国gibco公司)；成骨诱导分化培养基(广州赛业公司)。

1.4 细胞培养、分组及干预实验

MG-63细胞培养(培养基、传代、冻存和复苏)按常规方法。MG-63细胞分别接种于6孔塑料培养板，隔两天用PBS液进行细胞换液，细胞即将铺满培养板时进行细胞传代，细胞传第5代时用1 nmol/L，10 nmol/L,100 nmol/L,1 μmol/L,10 μmol/L淫羊藿苷各2ml进行干预，阴性对照组加入2 ml培养基，再各加入2 ml成骨诱导剂进行成骨诱导分化。

1.5 RT-PCR检测

干预后3、6天提取细胞RNA进行检测，用TRIZOL法提取细胞总RNA，配制10 μl的反应体系在梯度PCR仪上进行反转录。PCR法检测第3天MYC、CDK7细胞增殖相关基因的表达，第6天检测RUNX2、COL1A1、OPG、RANKL的表达，同时以GAPDH为内参，引物序列见表1。

表1 引物设计Table 1 The design of primers

PCR条件：预变性94 ℃ 5 min；变性94℃ 45 s，退火60 ℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，共40个循环，于72 ℃延伸10 min。

1.6 蛋白表达检测

干预6天后进行细胞总蛋白提取，采用Western blot检测OPG、RANKL、RUNX2、COL1A1蛋白质表达。

1.7 统计学分析

2 结果

不同浓度淫羊藿苷干预后OPG、RANKL、RUNX2、COL1A1、CDK7、MYC mRNA表达结果见图1，蛋白表达量见图2。对成骨分化相关基因，10 nmol、1 μmol干预的MG-63 RUNX2基因表达量较1 nmol及10 μmol的高(P<0.05)，与100 nmol及空白对照组没有明显差别(P>0.05)，10 μmol的RUNX2加而升高，10 μmol的表达量较其余各组有明显升高(P<0.05)，其蛋白表达也更多；RANKL的基因表达量极低，且在各组之间均无明显差异(P>0.05)，但100 nmol时趋于更多，10 nmol时趋于更少，而RANKL的蛋白表达无条带；OPG的表达在1 μmol浓度时较100 nmol、10 μmol明显增高(P<0.05)，与1 nmol、10 nmol及空白组没有统计学差异(P>0.05)，但1 μmol浓度时OPG表达量有增多趋势；与细胞增殖相关的MYC的表达各组之间均没有差异(P>0.05)，而CDK7的表达均较空白组降低(P<0.05)。

图1 不同浓度淫羊藿苷干预后各基因表达量注：*与对照组相比P<0.05；#与10μmol/L组相比P<0.05；**与1μmol/L组相比P<0.05Fig.1 The mRNA expression ofRUNX2,COL1A1,OPG and RANKL in MG-63 cells were determined by real-time PCR after treatment with different concentrations of Icariin for 6 days, and CDK7 and MYC for 3days.*Compared with the control group,P<0.05;# Compared with the treatment at 10 μmol/L, P<0.05;**Compared with the treatment at 1 μmol/L, P<0.05.

图2 不同浓度淫羊藿苷干预后各蛋白表达量Fig.2 The protein expression ofRUNX2,COL1A1,OPG and RANKL in MG-63 cells were determined by wetern-blot after treatment with different concentrations of Icariin for 6 days.

3 讨论

近几年多项实验已经表明淫羊藿苷在促进细胞成骨分化中具有重要作用[5-7]，Luo等人[5]研究发现10-5mol/L的淫羊藿苷能恢复体外老年去卵巢大鼠因雌激素减少和老龄所致的骨髓间充质干细胞向成骨分化减少的能力，主要是通过影响雌激素信号通路；Ma等人[6]发现10-5mol/L的淫羊藿苷比10-8mol/L的地塞米松更能明显促进大鼠成骨细胞的碱性磷酸酶活性和钙盐沉积；Song[7]进行实验发现淫羊藿苷可诱导MC3T3-E1细胞ERK和JNK的生成，而抑制MAPK信号通路可减少淫羊藿的促成骨效应，同时也抑制ERK和JNK的表达，说明其作用可能与MAPK信号通路相关。但大多数文献还是以动物细胞为研究对象，本研究针对人成骨样细胞MG-63受淫羊藿苷影响的表现特点，可能更接近人的成骨分化特征。

RUNX2和COL1A1是成骨分化的两个主要标志基因之一，10 μmol的淫羊藿苷能促进COL1A1基因和蛋白的表达，而RUNX2的mRNA表达在10 μmol最低，而蛋白含量在10 μmol最高，这与其它研究动物细胞的结果[6]不完全一致，这可能是淫羊藿苷作用于MG-63细胞的RUNX2的转录后调控有关。CDK7与MYC均是细胞增殖中的重要标志基因，尤其是CDK7，与对照组相比，淫羊藿苷明显抑制CDK7的表达，说明淫羊藿苷减少MG-63的细胞增殖，促进其进入细胞分化阶段，Song等[7]研究也表明淫羊藿苷能降低MC3T3-E1细胞CDK4的表达而促进细胞分化。

OPG/RANKL/RANK 系统在成骨与破骨细胞的相互平衡中起重要作用，OPG与RANKL能竞争性的结合RANK受体，而减少破骨细胞的生成。OPG、RANKL都是由成骨细胞系分泌的[8]，本实验以MG-63为研究对象，因其是体外研究成骨细胞功能具有代表性的细胞系。实验发现，MG-63中RANKL的RNA和蛋白表达量都极低，甚至包括在空白组，Gori等[8]认为在成骨分化过程中，RANKL的表达量会下降约5倍，而OPG的表达会上升7倍，RANKL表达量受明显抑制可能是原因之一；另外，Mori等[9]研究发现RANKL在MG-63、U2OS、HOB、SAOS-2、HOS等所有人成骨肉瘤中的表达量都极低，而Mogi等[10]发现OPG-RANKL复合体只在U2OS细胞中检测得到，在MG-63、HOB、SAOS-2、HOS细胞中都无法检测，这也可能是RANKL蛋白无法检测出的另一原因，但也有文献报道[11-12]MG-63可检测出表达量较高的RANKL，这些差异可能与细胞在体外培养的具有异质性，某些特性改变有关。虽然结果显示RANKL的mRNA表达量低，但淫羊藿苷浓度10nmol时其表达趋于更受抑制，Wang等[12]报道另一种异黄酮类葛根素1 μmol能明显抑制MG-63中RANKL的表达，同时淫羊藿苷能降低SW1353人软骨肉瘤细胞中RANKL的表达量[13]。

OPG/RANKL的比例增高可抑制破骨分化，Wang等[14]实验结果表明MG-63细胞中OPG的表达是受雌激素受体α(Estrogen receptor α，ERα)调节的，Luo等[5]研究发现淫羊藿苷可上调MG-63中ERα，但并没有文献报道淫羊藿苷对OPG/RANKL表达的直接影响，本实验中不同浓度的淫羊藿苷干预后的OPG、RANKL表达量与对照组相比均无明显差异，这说明很可能淫羊藿苷不通过上调OPG/RANKL来促进成骨分化，本实验未来将进一步研究其作用机制。

因此，本实验研究发现10 μmol/L的淫羊藿苷可明显促进COL1A1的表达量，从而促进成骨细胞的生成，但并不通过作用于OPG/RANKL系统起效。