来源于链霉菌Streptomyces albiflaviniger菌株YN-10-2的纳皮拉霉素类化合物的结构和活性

郭　凯，胡志钰,2，郑忠辉,2，徐庆妍,2*

(1.厦门大学 生命科学学院，天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，2.细胞应激生物学国家重点实验室(厦门大学)，福建厦门361102)



来源于链霉菌Streptomyces albiflaviniger菌株YN-10-2的纳皮拉霉素类化合物的结构和活性

郭凯1，胡志钰1,2，郑忠辉1,2，徐庆妍1,2*

(1.厦门大学 生命科学学院，天然产物源靶向药物国家地方联合工程实验室，2.细胞应激生物学国家重点实验室(厦门大学)，福建厦门361102)

摘要：对分离自云南大学校园的攀枝花苏铁根际土壤的链霉菌Streptomyces albiflaviniger菌株YN-10-2的化学成分进行结构和活性的研究.从20 L固体表面发酵产物的提取物中经过多种层析方法的综合运用，共分离纯化出6个纳皮拉霉素(napyradiomycin)家族化合物.通过对核磁共振谱图和质谱数据的解析以及文献的对照，确定了化合物的化学结构，分别为napyradiomycin B1(1)、napyradiomycin B3(2)、napyradiomycin C1(3)、napyradiomycin A2a(4)、napyradiomycin A2b(5)和3-chloro-6,8-dihydroxy-8-a-lapachone(6)，其中化合物4和5是差向异构体.在滤纸片抗菌实验中，化合物1～3显示出对金黄色葡萄球菌的抑制活性.

关键词：根际链霉菌；纳皮拉霉素；核磁共振；差向异构体；抗菌活性

纳皮拉霉素(napyradiomycin)是1986年从链霉菌中分离到的一类由萘醌母核与异戊二烯单元组合而成的含卤素的杂合萜类化合物，有抗菌活性和细胞毒活性[1-7].近年来发现，纳皮拉霉素具有有效抑制耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌和诱导细胞凋亡的活性，因而再次成为研究热点[1-2].

在对土壤放线菌的系统研究中，从生长于云南大学校园的国家一级保护植物攀枝花苏铁(CycaspanzhihuaensisZhou L et Yang S Y)的根际分离到一株有抗菌、抗肿瘤活性的链霉菌Streptomycesalbiflaviniger菌株YN-10-2，对该菌株的次级代谢产物进行分离纯化，从中鉴定出6个纳皮拉霉素类化合物.以多株指示菌和人源肿瘤细胞株分别进行抗菌、抗肿瘤活性测试，部分化合物表现出较好的抗菌活性.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器

反相硅胶色谱柱(RP-18,Merck)；凝胶柱(Sephadex LH-20，Pharmacia)；柱层析用正相硅胶(200～300目)；薄层层析(TLC)板(GF254,青岛海洋化工厂)；核磁共振(NMR)仪(DRX-600,Bruker)；Q-TOF质谱仪(Micro Mass,Waters)；液相色谱仪(1200 Series,Agilent).

1.1.2菌株与细胞株

抗菌活性测定指示菌：大肠杆菌(EscherichiacoliCMCC44103)、金黄色葡萄球菌(StaphlococcusaureusCMCC26003)、短小芽孢杆菌(BacilluspumilusCMCC63202)、藤黄微球菌(MicrococcusluteusCMCC28001)、白色假丝酵母(CandidaalbicansAS2.538)、黑曲霉(AspergillusnigerACCC30005).抗肿瘤活性测试细胞株：人宫颈癌Hela细胞、人肝癌HepG-2 细胞(购于中科院上海细胞所).菌株YN-10-2分离自云南大学校园攀枝花苏铁根际，经16S rRNA序列比对，与Streptomycesalbiflaviniger相似度99%(GenBank登录号：JQ682537)，故该菌株鉴定为StreptomycesalbiflavinigerYN-10-2.

1.1.3培养基

SYP培养基(可溶性淀粉10.0 g，酵母提取物4.0 g，蛋白胨2.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～ 7.4)；YMG培养基(酵母提取物4.0 g，麦芽提取物10.0 g，葡萄糖4.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～ 7.4)；燕麦培养基(燕麦片20.0 g，加水煮沸约20 min后过滤得滤出液，加微量盐溶液1 mL，蒸馏水1 L，pH 7.2～7.4.其中，微量盐溶液：FeSO4·7H2O 0.1 g，MnCl2·4H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，双蒸水100 mL)；Waksman合成培养基(甘油30.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，NaNO32.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.2～ 7.4).以上对应的固体培养基加入2%(质量分数)琼脂，灭菌方式为121 ℃高压灭菌20 min.

1.2方法

1.2.1菌株YN-10-2的培养基筛选

从固体YMG培养基试管斜面转接菌种于液体YMG培养基作为种子(250 mL锥形瓶，每瓶加入50 mL培养基)，放置于摇床，30 ℃、220 r/min培养72 h.然后分别转接到装有固体YMG、SYP、燕麦培养基和Waksman合成培养基的培养皿(直径90 mm)中培养，每个培养皿约20 mL培养基，每种培养基各500 mL，28 ℃下倒置静止培养20 d.再将培养物切碎，用V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(乙酸)=85∶15∶5的混合溶剂提取3～4遍，45 ℃减压浓缩蒸干.得到的粗提物溶于甲醇，用滤纸片扩散法测抗菌活性，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测抗肿瘤活性.根据粗提物的初步活性测试结果，SYP培养基有较好的抗菌和抗肿瘤活性，故将其作为发酵培养基.

1.2.2菌株YN-10-2的发酵

从固体YMG培养基试管斜面转接菌种于液体YMG培养基作为种子(250 mL锥形瓶，每瓶加入50 mL培养基)，放置于摇床，30 ℃、220 r/min培养72 h.再转接到固体SYP培养基，28 ℃下倒置静止培养20 d，共发酵20 L.

1.2.3发酵产物的分离纯化

收集20 d的培养基，切碎后用V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(乙酸)= 85∶15∶5的混合溶剂提取3～4遍，45 ℃减压浓缩蒸干.所得浸膏溶于甲醇，用等体积石油醚萃取至石油醚相无色，甲醇相45 ℃减压浓缩蒸干，用水分散后用等体积乙酸乙酯萃取至水相无色，乙酸乙酯相减压浓缩蒸干后，用甲醇溶解过滤，得甲醇提取物(4.8 g).

甲醇提取物(4.8 g)经反相硅胶色谱柱(RP-18，180 g)中压液相层析(MPLC)，甲醇-水系统洗脱：30%(甲醇体积分数，下同)2 L，50% 3 L，70% 4 L，合并70%洗脱组分得到Fr3(536.0 mg)和Fr4(917.1 mg).

Fr4(917.1 mg)经MPLC(RP-18，60 g)，丙酮-水系统洗脱：30%(丙酮体积分数，下同)200 mL，50% 200 mL，70% 400 mL，80% 400 mL，90% 200 mL，70%组分得到Fr41(220.5 mg)、Fr42(501.0 mg)和Fr43(88.0 mg).Fr41(220.5 mg)用甲醇溶解后，经Sephadex LH-20凝胶柱(140 g)层析，甲醇洗脱，流速5～6 mL/h，每小时收集1管，经TLC检测，合并36～59管(#36～59)得Fr412(55.5 mg).Fr412(55.5 mg)用正相硅胶色谱柱(5 g)分离，采用石油醚-丙酮体系洗脱(每管接收约10 mL)，洗脱体系为V(石油醚)∶V(丙酮)=12∶1，10∶1，8∶1，6∶1各100 mL，#1～17合并为F4121(未称量).F4121再用GF254制备型薄层层析(PTLC)制备板进行制备，展层体系为V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1，得到化合物4和5.Fr42用正相硅胶色谱柱(20 g)分离，采用石油醚-丙酮体系洗脱(每管接收约10 mL)，洗脱梯度为V(石油醚)∶V(丙酮)=15∶1，10∶1，9∶1，8∶1各100 mL，合并#8～20得Fr421(118.8 mg).Fr421经PTLC制备板进行制备，展层体系为V(石油醚)∶V(丙酮)=25∶1，得Fr4211(25.8 mg).Fr4211经高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化，流速为2 mL/min，甲醇-水体系65%～95%梯度洗脱30 min，得化合物1(5.1 mg，保留时间13 min)和化合物2(6.6 mg，保留时间17.5 min).Fr43(88 mg)经正相硅胶色谱柱(10 g)分离，采用石油醚-乙酸乙酯体系洗脱(每管接收约10 mL)，洗脱梯度为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=15∶1，10∶1，9∶1各150 mL，合并#17～25得Fr432(12.3 mg).Fr432用PTLC制备板进行制备，展层体系为V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=40∶1，得化合物6(7.3 mg).

Fr3(536 mg)甲醇溶解后，经Sephadex LH-20凝胶柱(140 g)层析，甲醇洗脱，流速5～6 mL/h，每小时收集1管，经TLC检测，合并#1～31得Fr31(34.5 mg)，合并#32～69得Fr32(217.3 mg).Fr31经Sephadex LH-20凝胶柱(80 g)层析，V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=1∶2洗脱，流速同上，经TLC检测，合并#30～53得Fr314(25 mg).Fr314用正相硅胶色谱柱(5 g)分离，采用石油醚-乙酸乙酯体系进行洗脱，洗脱梯度为V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=60∶1(共180 mL)，50∶1(共50 mL)，根据TLC检测结果，合并#2～8得Fr3141(10 mg)，合并#9～16得Fr3142(13 mg).Fr3141用PTLC制备板进行制备，展层体系为V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=50∶1，得化合物3(3.4 mg).

1.2.4NMR检测

将样品溶解于适量的氘代三氯甲烷中，装入干净核磁管进行测试，测试项目包括：一维核磁共振氢谱(1H-NMR)、一维核磁共振碳谱(13C-NMR)、无畸变极化转移增强谱(DEPT)、氢-氢同核位移相关谱(1H-1H COSY)、异核单量子相关谱(HSQC)、氢检测异核多键相关谱(HMBC)和核极化效应谱(NOESY)等.

1.2.5电喷雾质谱(ESI-MS)检测

样品经适当稀释后，溶解于色谱纯甲醇中，选择合适的离子源测试.

图1　化合物1～6(a～f)的质谱图Fig.1The mass spectra of compounds 1-6(a-f)

2结果与分析

通过各种色谱柱层析和TLC技术，初步分离到6个纳皮拉霉素系列化合物，根据一维、二维NMR数据鉴定了化合物1～6的结构.

2.1化合物1和2的结构鉴定

化合物1和2为淡黄色无定形粉末，能溶于甲醇、丙酮和三氯甲烷.13C-NMR和DEPT显示化合物1和2的结构中均有25个碳原子，包括4个甲基碳、5个亚甲基碳、5个次甲基碳、11个季碳.ESI-MS测得化合物1的准分子离子峰为m/z537.1[M+Na]+，推测其相对分子质量为514(图1)；结合1H-NMR、13C-NMR谱及HSQC二维谱，判断可能的分子式为C25H29Cl3O5；其比旋光值为-102.3(溶剂为甲醇，温度为25 ℃，质量浓度为0.1 g/L).化合物2的准分子离子峰为m/z559.1[M+H]+，推测其相对分子质量为558(图1);结合1H-NMR和13C-NMR谱及HSQC二维谱，判断可能的分子式为C25H29BrCl2O5；其比旋光值为-93.2(溶剂为甲醇，温度为25 ℃，质量浓度为0.1 g/L).

化合物1的1H-NMR：δ0.60(s，3H)，1.25(s，3H)，0.73(s，3H)，1.36(s，3H)，2.72，1.74(dd，m，2H)，2.09，1.73(m，m，2H)，2.34，2.14(m，m，2H)，2.67，2.51(d，dd，2H)，2.15(d，1H)，4.52(dd，1H)，3.96(dd，1H)，7.17(d，1H)，6.76(d，1H)，4.87(s，2H)；13C-NMR：δ15.0(CH3)，21.8(CH3)，25.8(CH3)，28.6(CH3)，34.3(CH2)，34.5(CH2)，35.3(CH2)，41.3(C)，42.3(CH2)，45.6(CH)，59.3(CH)，70.9(CH)，78.3(C)，81.5(C)，84.4(C)，108.0(C)，108.4(CH)，108.6(CH)，109.5(CH2)，135.1(C)，146.1(C)，165.6(C)，165.6(C)，192.8(C)，193.2(C).

化合物2的1H-NMR：δ0.65(s，3H)，1.25(s，3H)，0.73(s，3H)，1.36(s，3H)，2.74，1.75(dd，d，2H)，2.23，1.94(m，m，2H)，2.30，2.09(m，m，2H)，2.67，2.50(m，m，2H)，2.20(m，1H)，4.51(dd，1H)，4.21(dd，1H)，6.76(d,1H)，7.17(d，1H)，4.83(s，2H)；13C-NMR：δ15.7(CH3)，21.8(CH3)，27.2(CH3)，29.7(CH3)，34.7(CH2)，35.9(CH2)，37.0(CH2)，41.3(C)，42.3(CH2)，45.5(CH)，59.3(CH)，67.1(CH)，78.3(C)，81.6(C)，84.4(C)，108.4(CH)，108.5(CH)，108.5(C)，109.4(CH2)，135.1(C)，146.0(C)，165.4(C)，165.9(C)，192.7(C)，193.1(C).

化合物1和2的NMR谱图进行比较，两者结构相似，唯一区别是C-16上，化合物1是氯取代(δH-16=3.96，δC-16=70.9)，化合物2是溴取代(δH-16=4.21，δC-16=67.1).结合文献[8]报道，确定化合物1是napyradiomycin B1，化合物2是napyradiomycin B3(图2).

2.2化合物3的结构鉴定

化合物3是淡黄色无定形粉末，能溶于甲醇、丙酮和三氯甲烷.13C-NMR和DEPT显示化合物3有25个碳，包括4个甲基碳、5个亚甲基碳、4个次甲基碳、12个季碳.ESI-MS测得化合物3的准分子离子峰为m/z479.3[M+H]+，推测其相对分子质量为478(图1)；结合1H-NMR、13C-NMR谱及HSQC二维谱，得出可能的分子式为C25H28Cl2O5；其比旋光值为39.8(溶剂为甲醇，温度为25 ℃，质量浓度为0.1 g/L).

化合物3的1H-NMR：δ1.18(s，3H)，1.78(s，3H)，1.35(s，3H)，2.06，1.81(m，m，2H)，1.57(s，3H)，3.44(dd，2H)，2.06，1.60(m，m，2H)，2.56，2.38(m，m，2H)，2.63(m，2H)，4.53(dd，1H)，7.27(br，1H)，4.73(dd，1H)，3.18(d，1H)；13C-NMR：δ13.5(CH3)，18.3(CH3)，22.4(CH3)，23.0(CH2)，29.2(CH3)，31.3(CH2)，39.8(CH2)，42.0(CH2)，42.2(CH2)，58.9(CH)，77.8(C)，79.2(C)，84.8(C)，107.8(CH)，111.1(C)，118.3(CH)，122.0(CH)，124.1(C)，132.1(C)，133.4(C)，139.6(C)，162.2(C)，164.6(C)，194.1(C)，195.9(C).

通过与文献[8]中NMR数据进行对照，确定化合物3是napyradiomycin C1(图2).

2.3化合物4和5的结构鉴定

化合物4和5是黄色无定形粉末，能溶于甲醇、丙酮和三氯甲烷.13C-NMR和DEPT显示化合物4和5有25个碳，包括4个甲基碳、5个亚甲基碳、5个次甲基碳、11个季碳.ESI-MS测得化合物4和5的准分子离子峰为m/z519.1[M+Na]+，得出相对分子质量为496(图 1)；结合1H-NMR、13C-NMR谱及HSQC二维谱，推断二者的分子式均为C25H30Cl2O6；化合物4比旋光值为47.2(溶剂为甲醇，温度为23 ℃，质量浓度为0.1 g/L)，化合物5比旋光值为31.3(溶剂为甲醇，温度为23 ℃，质量浓度为0.1 g/L).在V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1的TLC检测中，二者的比移值(Rf)分别为0.95和0.97.对照文献[9-10]报道的数据，确定化合物4和5是napyradiomycin A2的差向异构体，它们的区别在于C-16的绝对构型不同：化合物4和文献[9]报道的napyradiomycin A2a(R型)的δC-16都是75.3，所以化合物4的C-16绝对构型是R型；化合物5和文献[10]报道的napyradiomycin A2b(S型)的δC-16分别是75.9和76.0，所以化合物5的C-16绝对构型是S型(表1，图2).

2.4化合物6的结构鉴定

化合物6为深红色粉末，易溶于甲醇、丙酮和三氯甲烷.13C-NMR和DEPT显示化合物6有15个碳，包括2个甲基碳、1个亚甲基碳、3个次甲基碳、9个季碳.ESI-MS测得化合物6的准分子离子峰为m/z309.2[M+H]+，推测其相对分子质量为308(图1)；结合1H-NMR、13C-NMR谱及HSQC二维谱，得出可能的分子式是C15H13ClO5；其比旋光值为16.1(溶剂为甲醇，温度为23 ℃，质量浓度为0.1 g/L).

化合物6的1H-NMR：δ1.53(s，3H)，1.50(s，3H)，2.89，3.12(d，d，2H)，6.53(d，H)，7.04(d，H)；13C-NMR：δ21.9(CH3)，24.0(CH3)，25.6(CH2)，57.7(CH)，79.9(C)，106.9(C)，107.7(CH)，108.0(CH)，117.4(C)，132.8(C)，153.0(C)，163.6(C)，164.2(C)，178.7(C)，187.8(C).

根据文献[3]报道的NMR数据，确定化合物6是3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α-lapachone(图2).

2.5化合物1～6的活性测试

以人宫颈癌Hela细胞和肝癌HepG-2 细胞，采用

MTT法进行化合物的细胞毒活性测试(化合物浓度为50 mmol/L)[11],未发现化合物在该浓度下有活性.以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和白色假丝酵母、黑曲霉为指示菌，采用滤纸片扩散法测化合物抗菌活性，化合物配制质量浓度为5 mg/mL[11]；测试时，每个纸片上加入20 μg化合物.化合物1、2和3表现出较好的抗金黄色葡萄球菌活性，抑菌圈平均直径分别为13，13，11 mm(每组重复3次，阳性对照为庆大霉素，抑菌圈直径为22 mm，阴性对照为空白溶剂，抑菌圈直径为0 mm)(图 3).与庆大霉素相比，化合物1～3仅表现出对金黄色葡萄球菌的抑制作用，而化合物4～6没有表现出抑菌活性.进一步以金黄色葡萄球菌为测试菌，以庆大霉素为阳性对照，测试化合物1～3的最低抑菌质量浓度(MIC)，每个化合物和阳性对照重复3次，取平均值，化合物1～3的MIC值均为16 μg/mL,阳性对照为8 μg/mL.

3讨论

早期开展的寻找纳皮拉霉素研究，主要集中在陆源放线菌的次级代谢产物上.这包括Shiomi等于1986年、1987年从来自日本新泻县土样中的放线菌ChainiarubraMG 802-AF1分离出纳皮拉霉素A1、B1、B2、C1、C2、A2、B4[8-9,12]；Gomi等于1987年从来自日本鸟取县土样中的链霉菌S.aculeolatusSF2415分离到纳皮拉霉素A1、A2、A3、B1、B2、B3[13-14]；Fukuda等于1989年从来自帕劳群岛、加罗林群岛土样中的链霉菌S.aculeolatusA80915分离到纳皮拉霉素A、B、C、D[4].

然而，随着时间推移，特别是进入21世纪以来，从土壤放线菌中寻找纳皮拉霉菌的努力趋向于沉寂，研究者们纷纷把目光投向了海洋放线菌.Jensen等认为，从系统进化的研究分析来看，海洋链霉菌中的MAR4家族世系具有很大的产生包括纳皮拉霉素在内的杂合萜化合物的能力[15].Fencical等从MAR4家族海洋链霉菌CNQ-525、CNQ-329、CNH-070中分离纯化出一系列结构新颖的纳皮拉霉素[1,5-6],又从S.antimycoticusNT17中分离出一系列结构新颖的纳皮拉霉素以及与之结构有相关性的衍生物[10].

本研究从来源自西南内陆的云南省根际土壤链霉菌S.albiflavinigerYN-10-2中分离到6个纳皮拉霉素系列化合物，它们分别属于纳皮拉霉素A、B、C系列以及萘醌异戊二烯，但仅化合物1～3有较好的抑制金黄色葡萄球菌的活性.6个化合物均未发现有抑制人宫颈癌 Hela 细胞和肝癌 HepG-2 细胞的活性，原因可能是细胞毒活性来自数个化合物的综合作用而非单体化合物，或者来自还未分离到的其他成分，且本实验细胞测试模型相对较少，需要在更多模型上测试分析.总之，本研究表明陆生来源的这一链霉菌菌株具有进一步研究开发结构多样且有生物活性的化合物的潜力.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201511002

收稿日期：2015-11-02录用日期：2016-02-23

基金项目：厦门市科技计划项目(3502z20123010)

*通信作者：xuqingyan@xmu.edu.cn

中图分类号:R 93

文献标志码：A

文章编号：0438-0479(2016)04-0478-07

Structures and Bioactivities of Napyradiomycins Compounds from Streptomyces albiflaviniger YN-10-2

GUO Kai1,HU Zhiyu1,2,ZHENG Zhonghui1,2，XU Qingyan1,2*

(1.State-Province Joint Engineering Laboratory of Targeted Drugs from Natural Products,School of Life Sciences,Xiamcn University,2.State Key Laboratory of Cellular Stress Biology，Xiamen University,Xiamen 361102,China)

Abstract:A rhizosphere strain Streptomyces albiflaviniger YN-10-2 isolated from Cycas panzhihuaensis Zhou L et Yang S Y at Yunnan University was chosen to study its secondary metabolites.Six napyradiomycins compounds were purified from 20 L solid fermentation culture.Their chemical structures were elucidated mainly by spectroscopic analyses including nuclear magnetic resonance(NMR) spectroscopy and electrospray ionization mass spectroscopy(ESI-MS).Results showed that these six compounds were identified as napyradiomycin B1(1),napyradiomycin B3(2),napyradiomycin C1(3),napyradiomycin A2a(4),napyradiomycin A2b(5) and 3-chloro-6,8-dihydroxy-8-α-lapachone(6),respectively.Among these compounds,napyradiomycins A2a(4) and A2b(5) are epimers.Additionally,compounds 1-3 exhibited inhibitory activities against Staphylococcus aureus in the antimicrobial tests by disc diffusion assay.

Key words:rhizosphere Streptomyces;napyradiomycin;nuclear magnetic resonance(NMR);epimer;antimicrobial activity

引文格式：郭凯，胡志钰，郑忠辉，等.来源于链霉菌Streptomycesalbiflaviniger菌株YN-10-2的纳皮拉霉素类化合物的结构和活性[J].厦门大学学报(自然科学版)，2016,55(4)：478-484.

Citation：GUO K,HU Z Y,ZHENG Z H,et al．Structures and bioactivities of napyradiomycins compounds fromStreptomycesalbiflavinigerYN-10-2[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：478-484．(in Chinese)