显微镜下精索静脉结扎对精子DNA完整性的影响

张　健，许　鹏，斯坎达尔，陈涤平，王玉杰

(新疆医科大学第一附属医院泌尿中心,乌鲁木齐　830054)



·临床研究·

显微镜下精索静脉结扎对精子DNA完整性的影响

张健，许鹏，斯坎达尔，陈涤平，王玉杰

(新疆医科大学第一附属医院泌尿中心,乌鲁木齐830054)

摘要：目的探讨显微镜下精索静脉结扎对精索静脉曲张(VC)患者精子DNA完整性的影响，为临床男性不育症的治疗提供理论依据。方法40例健康对照组及62例VC组测定精子DNA碎片率(DFI)，VC组62例患者行显微镜下精索静脉结扎术，术后3个月及6个月复查精子DFI，与术前比较。结果术前VC组和对照组的DFI平均水平分别为(30.42±8.57) %和(12.26±5.57) %，组间差异具有统计学意义(P<0.01)；VC组患者术后3个月和6个月DFI平均水平分别为(22.65±5.57)%和(17.65±5.48) %。结论VC可导致患者精子DFI偏高，行显微镜下精索静脉结扎后患者的精子DFI水平较术前明显降低；VC的分度以及术前精液分析正常与否和VC患者的精子DFI无明显相关性。

关键词:精索静脉曲张(VC)；精子DNA碎片率(DFI)；显微镜下精索静脉结扎术；男性不育

精索静脉曲张(varicocele，VC)是指由于各种原因引起精索蔓状静脉丛血液回流不畅，局部静脉异常扩张、迂曲的病理改变，是一种常见的男科疾病。有统计指出，成年男性VC患者中，约35%伴有不育[1]，而由于VC所导致的不育占男性不育的25%～40%。因此，VC与男性不育密切相关。精子DNA碎片率(DNAfragmentationindex，DFI)是近几年研究较热的评价精液质量和预测生育能力的新指标，从DNA层面反应精子功能。研究表明，部分精液分析正常的不育患者精子DNA碎片率明显高于正常男性，对于VC不育患者也有精液分析正常而精子DFI已明显升高。这说明精子DFI检测能更好地反应精子的生殖功能。本研究旨在通过比较VC不育男性行显微镜下精索静脉结扎后DFI变化，分析精子DNA碎片率与VC的关系，为临床治疗VC提供更多的理论依据。

1对象与方法

1.1研究对象纳入标准2014年7月至2014年12月在新疆医科大学第一附属医院就诊，诊断为左侧精索静脉曲张且不育，行专科查体及精索+阴囊彩色多普勒超声检查，配偶在我院行妇科生殖检查均未见异常的62例患者纳入VC组(其中Ⅰ度曲张17例、Ⅱ度曲张31例、Ⅲ度曲张14例)；健康对照组取无生殖系统疾病史、配偶均在1年内正常生育者40例。排除标准：双侧VC、重度少精症(<5×106/mL)、无精子症、脑垂体病变、染色体异常、外生殖器先天性病变、泌尿生殖道外伤及严重感染、双侧睾丸容积相差>4mL等以及系统性疾病、肿瘤治疗、长期吸烟、酗酒和服药等影响生育的疾病和不良嗜好。

1.2手术方法VC组患者均充分知情同意并签署手术知情同意书后，由我院相同的手术小组人员统一施行经显微镜下左侧精索静脉结扎术，切口均采取外环下横行切口。

1.3检测指标VC组及对照组行精液分析、精子巴氏染色形态分析及精子染色质扩散试验 (spermchromatindispersiontest，SCD)检测DFI。所有研究对象于术后3月及术后6月复查精液分析、精子巴氏染色形态分析及DFI检测。

1.4实验方法按照WHO推荐的精液检查方法，所有研究对象均禁欲2～7d，在我院产前诊断中心取精室通过手淫法留取精液于干燥清洁取精杯中，置37 ℃恒温水浴箱待完全液化后，进行精液参数分析。分析指标包括精液量、pH值、精子浓度、精子活力(a+b)等。精子形态检测采用巴氏染色形态分析。DFI检测采用SCD法(具体步骤详见产品使用说明书)。

1.5实验仪器及试剂精液分析采用辅助精液分析系统WLJY-9000型精子自动分析仪(北京伟力公司)、光学显微镜NIKON(日本)、离心机；精子DNA碎片率检测采用精子DNA碎片染色试剂盒(瑞-吉染色法)，购自安徽安科生物工程(集团)股份有限公司。

1.6统计方法统计学分析采用SPSS17.0统计学软件。计量资料数据用均数±标准差表示，手术前后组间DFI值的比较采用配对样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

术前VC组和对照组的DFI平均水平分别为(30.42±8.57) %和(12.26±5.57)%，组间比较差异具有统计学意义(t=11.303，P<0.01)。术后3个月VC组精子浓度较术前有所增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，a+b级精子比例及精子正常形态比例较术前无明显统计学差异(P>0.05)，而精子DFI较术前明显降低，差异具有显著统计学差异(P<0.05)。术后6个月，VC组精子浓度、a+b级精子比例及精子DFI较术前均有显著统计学差异(P<0.05)，而精子正常形态比例较术前虽有所增加，但差异不具有统计学意义(P>0.05，表1)。

所有VC患者术后3个月及术后6个月精子DFI较术前均有明显降低，VCⅠ度、Ⅱ度、Ⅲ度患者间有显著统计学差异(P<0.05)。术后3个月、6个月，DFI降低程度与曲张分度的相关系数分别为0.069(P=0.593)和0.169(P=0.190)，即DIF降低与VC的分度无明显相关性(表2)。

无论精液分析异常(以精子浓度<20×106/mL或a+b级精子比例<50%为标准)或正常(以精子浓度>20×106/mL且a+b级精子比例>50%为标准)的VC患者术后3月及6月精子DFI下降较术前相比，均有显著统计学意义(P<0.05)。术后3个月，精液分析正常的VC患者DFI改变量为(6.37±3.54)%，精液分析异常患者为(9.09±5.24)%，术后3个月，精液分析异常患者DFI改变量大于精液分析正常患者(t=-2.386，P=0.02)；术后6个月，精液分析正常和异常的VC患者DFI改变量分别为(11.70±4.74)%，(13.78±6.44)%，组间无统计学差异(t=-1.442，P=0.155，表3)，说明短期内精液分析异常组DFI改变量大，但长期趋势与精液分析正常与否无关。

精液参数术前术后3月术后6月精子浓度(106/mL)37.97±27.3446.57±22.09*53.08±21.06*a+b级精子比例(%)57.86±20.0658.03±18.4870.80±13.48*正常精子形态比例(%)4.43±2.744.68±2.045.04±2.42精子DFI(%)30.42±8.5*22.65±5.57*17.65±5.48*

与术前相比，*P<0.05。

与术前相比，*P<0.05。

与术前相比，*P<0.05。

3讨论

VC导致男性不育的机制一直是国内外研究的热点，但目前尚没有一种学说能够完全阐明VC导致男性不育的确切机制，目前比较受到认可的机制主要有氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)损伤，也有学者提出生殖细胞凋亡是主要原因[2-4]，还有睾丸局部温度升高、局部代谢产物增加以及缺氧等，其中ROS学说被认为是最具说服力的VC导致不育的可能原因。ROS是一类有高反应活性的含氧基团，生理状态下，这些含氧基团在精子获能、顶体反应等过程中有重要作用，机体存在多种一定水平的抗氧化物质，这些抗氧化物质使得ROS的产生和消除处于动态平衡，对维持机体的正常生精有重要意义。VC时由于睾丸组织供氧不足、无糖酵解增加，从而使得睾丸局部组织发生缺氧、代谢性酸中毒，三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)分解产生对组织细胞有损伤的ROS基，ROS增加后，氧化与抗氧化失衡。这些活性氧基团损伤精子头部的细胞膜，使得位于精子头部的染色质暴露于高浓度的ROS环境中，高浓度的ROS对精子有毒性作用，并可直接损伤精子核内及线粒体内的DNA,诱发DNA双链断裂和单链形成，从而使精子DNA碎片率升高。有国内学者指出，ROS可能通过直接氧化精子DNA碱基,也可能通过脂质过氧化产物与DNA的共价键结合,引起精子DNA双链断裂[5]。氧化应激还可以影响到精子核酸和蛋白质的结构和功能，引发精子DNA损伤等[6 ]。国外有实验研究得出:VC患者行精索静脉结扎术后,精子DNA完整性能够得到显著提高,同时术后患者精浆抗氧化能力增强,而使氧化应激减弱[7-8 ]。

本研究结果显示：VC患者行显微镜下精索静脉结扎后精子的浓度、a+b级精子比例较术前有显著升高(P<0.05)，而精子DNA碎片率较术前有显著降低(P<0.05)，这与AI等[9]的研究结果相一致。精液分析正常的VC不育患者精子DFI水平明显高于健康正常对照组(P<0.05)，这表明VC对精液的损伤是一个渐变的过程，精子DNA损伤较精液分析的各项指标变化能更早的表现出来。ZINI[10]等的研究指出：不育症患者的精子DNA碎片率明显高于正常人群，且精液分析的各项指标正常并不表示精子无DNA碎片化[7]。这提示了精子DNA碎片率较精液分析的各项指标更为敏感，它能在精子受损，精液参数表现正常时即明显升高。许多原因不明的不育患者，精子DNA碎片率明显高于正常人群也印证了这一点。本研究结果还显示：不但术前精液分析异常的VC不育患者术后精子DFI较术前有明显下降，术前精液分析正常的VC不育患者术后精子DFI较术前也有明显降低，差异具有显著统计学意义(P<0.05)。国外BUNGUM等[11]的研究显示：当精子DNA碎片率大于30%，男性生育的可能将大幅降低。而SERGERIE等[12]的研究指出：把精子DNA碎片化程度为20%作为分界值,区别不育和生育力正常的特异度是89.4%,敏感度是96.9%。精液分析正常的VC患者测定精子DNA碎片率明显高于对照组，这很有可能就是部分精液分析正常的VC患者不育的原因。因此，对于VC患者而言，一旦确诊，在行精液分析的同时及早行精子DNA碎片率检测能更早的发现问题，及早行精子DNA碎片率检测是非常有必要的。术后3个月，研究对象组的精子DFI较术前明显下降，有显著的统计学差异，而精子浓度、精子正常形态比例无统计学差异。到术后6个月，研究对象组的精子浓度较术前有统计学差异，而精子正常形态比例虽有所上升，但不具有统计学差异。这进一步说明精子DNA碎片率较精液分析更为敏感。目前的生理学研究显示：精子从发生到形成的周期约2个月，若生精功能受损，修复则需要若干个周期才能逐步恢复正常。我们在临床中发现，个别重度少精症(精子浓度<5×106/mL)的VC患者，对其测定精子DNA碎片率，其精子DFI与正常人群相差不大，有些甚至低于正常人群，其具体原因尚未可知。我们考虑：①精子浓度较低时，精液中的精子有更好的生存环境，比如能量供应、某些生化指标等；②重度少精症患者有可能存在曲细精管局灶节段性生精的可能，即大部分曲细精管已不能产生精子，但仍有少许的曲细精管能产生精子，而且能产生正常的精子。当然，这一假设有待今后更多研究的验证，故在本研究中，我们将重度少精症患者予以剔除。Ⅰ度、Ⅱ度、Ⅲ度的VC患者术后精子DFI较术前均明显降低，且Ⅰ度、Ⅱ度的VC患者术后精子DFI下降较Ⅲ度VC患者更加显著，其具体原因还不明确，但DFI的下降与VC的分度似乎无明显的相关性。

国外有相关报道声称：精子DNA损伤与自然受孕率以及辅助生殖受孕率降低有关[11、13]。尽管国内外有许多研究报道了VC患者手术后精液分析某些参数及女方受孕率都有所提高，但手术对男性生育的真实影响仍然存在争议。IAVIGNERA等[14]报道称：VC患者行精索静脉结扎术后，精子细胞凋亡标记物较术前降低了，ZINI等[10]研究表明：VC患者行精索静脉结扎术后，精子DNA完整性以及染色质的稳定性较术前均有明显增加，在这一点上许多研究也得到了相同的结论[14-16]。

总之，VC可引起患者精子DNA碎片率明显升高，这与患者精液分析是否正常以及VC的分度无明显相关性。行显微镜下精索静脉结扎后，患者精子DNA碎片率明显下降。故对于精子DFI偏高的VC患者，不论其分度几何以及精液分析正常与否，应考虑行手术治疗。

参考文献：

[1]FRENCHDB,DESAINR,AGARWALA.Varicocelerepair:Doesitstillhavearoleininfertilitytreatment?[J].CurrOpinObstetGynecol,2008,20(3):269-274.

[2]LUEYH,LASLEYBL，LAUGHLINLS，etal.Mildtesticularhyperthermiainducesprofoundtransitionalspermatogenicsuppressionthroughincreasedgermcellapoptosisinadultcynomolgusmonkeys(Macacafascicularis) [J].JAndrol,2002,23(6):799-805．

[3]BANKSS,KINGSA，IRVINEDS，etal.ImpactofamildscrotalheatstressonDNAintegrityinmurinespermatozoa[J].Reproduction，2005，129(4)：505-514．

[4]REEKERJC，MAPPFL，GARGESJB，etal．Effectsofhyperthermiaonspermatogenesis，apoptesis，geneexpression，andfertilityinadultmalemice[J]．BiolReprod,2001，65(1):229-239．

[5] 戴汝琳,刘睿智.影响精子DNA损伤因素研究进展[J].生殖与避孕,2009(06):385-389.

[6]KOTHARIS，THOMPSONA，AGARWALA，etal．Freeradicals：Theirbeneficialanddetrimentaleffectsonspermfunction[J]．IndianJExpBiol，2010，48(5)：425.

[7]SMITHR,KAUNEH,PARODID,etal.IncreasedspermDNAdamageinpatientswithvaricocele:relationshipwithseminaloxidativestress[J].HumReprod,2006,21(4):986-993.

[8]ZINIA,BLUMENFELDA,LIBMANJ,WILLISJ.BeneficialeffectofmicrosurgicalvaricocelectomyonhumanspermDNAintegrity[J].HumReprod,2005,20(4):1018-1021.

[9]AIBA,LOK,GroberE,etal.Timeforimprovementinsemenparametersaftervaricocelectomy[J].JUrol,2012,187(1):227-231.

[10]ZINIA,BOMANJM,BELZILEE,etal.SpermDNAdamageisassociatedwithanincreasedriskofpregnancylossafterIVFandICSI:systematicreviewandmeta-analysis[J].HumReprod,2008,23(12):2663-2668.

[11]BUNGUMM,HUMAIDANP,AXMONA,etal.SpermDNAintegrityassessmentinpredictionofassistedreproductiontechnologyoutcome[J].HumReprod,2007,22(1):174-179.

[12]SERGERIEM,LAFORESTG,BUJANL,etal.SpermDNAfragmentation:thresholdvalueinmalefertility[J].HumReprod, 2005, 20(12):3446-3451.

[13]GIWERCMANA,LINDSTEDTL,LARSSONM,etal.Spermchromatinstructureassayasanindependentpredictoroffertilityinvivo:acase-controlstudy[J].IntJAndrol，2010,33: 221-227.

[14]LAVIGNERAS,CONDORELLIR,VICARIE,etal.EffectsofvaricocelectomyonspermDNAfragmentation,mitochondrialfunction,chromatincondensation,andapoptosis[J].JAndrol2012,33: 389-396.

[15]SADEKA,ALMOHAMDYAS,ZAKIA,etal.Spermchromatincondensationininfertilemenwithvaricocelebeforeandaftersurgicalrepair[J].FertilSteril2011，95: 1705-1708.

[16]MCGILLJ,BAKERK,SHARMAR,etal.EffectofmicrosurgicalvaricoceleligationonspermDNAfragmentation,spermconcentration,andtotalmotilespermcountinsubfertilemen,ProceedingoftheAUAAnnualMeeting[C].Atlanta:[s.n], 2012.

(编辑王玮)

收稿日期：2015-08-22修回日期：2016-01-04

基金项目：新医大一附院2014年院内自然科学基金

通讯作者：陈涤平，主任医师，E-mail：cdp1958@sina.com

作者简介:张健(1989-),男(汉族)，硕士，泌尿男科专业. E-mail：993558708@qq.com

中图分类号:R697.24

文献标志码:A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.04.009

The effect of microsurgical varicocelectomy on sperm DNA fragmentation

ZHANG Jian, XU Peng, Sikandaer, CHEN Di-ping, WANG Yu-jie

(DepartmentofUrology,FirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China)

ABSTRACT:Objective To investigate the effect of microsurgical varicocelectomy on sperm DNA fragmentation in varicocele (VC) patients, in order to provide information for the treatment of male infertility.MethodsA total of 40 healthy controls and 62 VC patients who underwent microsurgical varicocelectomy were recruited in the study. The sperm DNA fragmentation Index (DFI) of healthy controls and VC patients before and after microsurgical varicocelectomy were compared. ResultsThe DFI of healthy controls was (12.26±5.57)%, while that of VC patients before operation was (30.42±8.57)%, which remarkably decreased 3 months (22.65±5.57)% and 6 months (17.65±5.48)% after surgery. Conclusion VC can lead to increased sperm DFI, while microsurgical varicocelectomy can decrease it. The grades of VC and semen parameters are not correlated with sperm DFI.

KEY WORDS:varicocele; sperm DNA fragmentation index; microsurgical varicocelectomy;male infertility

(No.2014ZRQN18)