液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶和奶粉中5种非蛋白含氮化合物

侯建波，谢　文，李　杰，陆　顺，祝泽龙，姚滨滨

(1.浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，浙江 杭州　310016；2.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州　310016；3.浙江立德产品技术有限公司，浙江 杭州　310016)



液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶和奶粉中5种非蛋白含氮化合物

侯建波1,2，谢文1,2，李杰3，陆顺3，祝泽龙3，姚滨滨3

(1.浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，浙江 杭州310016；2.浙江省检验检疫科学技术研究院，浙江 杭州310016；3.浙江立德产品技术有限公司，浙江 杭州310016)

摘要：建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定牛奶和奶粉中地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺 5种非蛋白含氮化合物的方法。样品经乙腈沉淀蛋白并提取，正己烷脱脂，HLB固相萃取柱净化，LC-MS/MS法检测，同位素稀释内标法或外标法定量分析。结果表明：地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺在牛奶样品中的定量限(S/N=10)分别为0.5、2.5、20、5、15 μg/kg，在奶粉样品中的定量限(S/N=10)分别为8、35、50、40、50 μg/kg；方法的线性关系良好，线性相关系数R2大于0.991；回收率为72.4%～102.8%，相对标准偏差(RSD)为1.3%～12.3%。采用该方法检测55批次牛奶和奶粉样品中5种化合物的残留情况，其中阳性样品的测定结果与国家标准方法的测定结果一致，验证了方法的可靠性。该方法简便、快捷，定量限可满足目前国内外最大残留限量的要求，可作为乳制品中相关化合物残留量的测定方法。

关键词：牛奶；奶粉；液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)；非蛋白含氮化合物；同时测定

奶制品是人类最古老的天然饮品之一，由于物美价廉、营养丰富、食用方便、容易消化吸收，被称为“白色血液”。随着人民对牛奶营养价值认可度的不断提高，对其品质要求也越来越高，牛奶中的含氮量是判定牛奶品质的一个重要指标。以凯氏定氮法为代表的测定方法可以实现样品中粗蛋白含量的测定[1]，但无法区分氮的来源，使得非蛋白氮掺假无法得到有效控制。非蛋白氮掺假乳制品严重危害人体健康，其中以2008年三鹿公司的“三聚氰胺事件”最为突出，2012年在新西兰乳品巨头恒天然的部分奶制品中检测到了双氰胺残留。一些国家和地区对食品中非蛋白含氮化合物的使用进行了明确的限量规定：美国和欧盟规定畜产品中环丙氨嗪最高残留量为0.05 mg/kg；2002年我国农业部《动物性食品中兽药残留最高限量》规定环丙氨嗪在禽产品中的最高残留限量为0.05 mg/kg，在羊肌肉、脂肪、肝、肾中的最高残留限量为0.3 mg/kg；2011年卫生部规定乳制品中三聚氰胺的最高残留限量为婴幼儿配方乳粉1 mg/kg，液态奶(包括原料乳)、奶粉和其他配方乳粉2.5 mg/kg，含乳15%以上的其他食品2.5 mg/kg。

目前，对三聚氰胺、双氰胺及其类似物的测定方法有分光光度法[2-4]，红外光谱法[5]，气相色谱-质谱法[6]，高效液相色谱法[7-10]和液相色谱-串联质谱法[11-12]。我国制定了一系列检测标准[13-15]，实现了检测技术的标准化。随着分离分析技术的发展，多残留同时检测的手段也逐步被开发[16-18]，然而，关于乳制品中多种非蛋白含氮化合物同时检测的报道仍然较少。

本工作拟采用液相色谱-串联质谱法同时测定牛奶和奶粉中地昔尼尔(dicyclanil)，双氰胺(dicyandiamide)，缩二脲(biuret)，环丙氨嗪(cyromazine)和三聚氰胺(melamine)，并将测定结果与国家标准方法GB/T 22388—2008进行比较，验证方法的可靠性，希望为乳制品中相关化合物残留量的检测提供一种简便快捷的方法。

1实验部分

1.1主要仪器与装置

1260-6490型液相色谱-串联质谱仪：美国Agilent公司产品，配有电喷雾离子源；固相萃取装置：美国Supelco公司产品； R-210旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司产品；氮吹仪：美国Organomation公司产品；台式离心机：美国Thermo 公司产品；Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司产品；HLB柱：美国Waters公司产品。

1.2主要材料与试剂

乙腈、正己烷、甲醇和甲酸：均为色谱纯，美国Tedia公司产品；实验用水：Milli-Q高纯水；氨水：分析纯，上海国药集团产品；地昔尼尔、双氰胺、缩二脲、环丙氨嗪和三聚氰胺以及同位素内标物标准品：纯度均大于98%，美国Sigma公司产品；用乙腈溶解各化合物，稀释并定容，获得10 mg/L标准储备液，实验时根据需要用乙腈将其稀释至所需浓度。

1.3实验方法

1.3.1样品的提取称取1.00 g牛奶样品和1.25 g奶粉样品(精确至0.01 g)，分别置于50 mL具塞离心试管中；用水溶解奶粉样品，并定容至10 mL；准确移取1 mL样品溶液，添加100 ng三聚氰胺-15N3内标物，加乙腈至20 mL，涡旋60 s，超声10 min，再以8 500 r/min离心5 min，取10 mL上清液；加入7 mL正己烷，涡旋，去除上层正己烷相，将下层溶液浓缩至近干，待净化。

1.3.2样品的净化向上述残渣中加入3 mL 5%氨化乙腈进行溶解，涡旋，过HLB固相萃取柱，重复操作1次；收集6 mL洗脱溶液，减压浓缩至近干；用乙腈-含5 mmol/L乙酸铵的0.15%甲酸水溶液(9∶1，V/V)定容至2 mL，过0.22 μm滤膜，待液相色谱-串联质谱测定。

1.3.3色谱条件色谱柱：XBridge HILIC柱(4.6 mm×150 mm×3.5 μm)；流动相：A为含5 mmol/L乙酸铵的0.15%甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.4 mL/min；梯度洗脱程序：0～3.0 min、10%～50%A，3.0～8.0 min、50%A，8.0～9.0 min、50%～10%A，9.0～20.0 min、10%A；进样量：10 μL；柱温：40 ℃。

1.3.4质谱条件电喷雾离子源(ESI)；正离子扫描；多反应监测模式；电喷雾电压：3 500 V；离子源温度：250 ℃；干燥气温度：250 ℃；干燥气流量：16 L/min；雾化气压力：275.8 kPa；鞘气温度：350 ℃；鞘气流量：10 L/min。其他质谱条件列于表1。

表1　各化合物的基本信息及质谱测定条件

注：*表示定量离子对

2结果与讨论

2.1提取溶剂的选择

本实验考察了三氯乙酸沉淀蛋白和有机溶剂沉淀蛋白两种提取方式。结果发现，在牛奶中直接加入三氯乙酸进行蛋白沉淀净化，其提取溶剂较难浓缩，测定的化合物信号响应很低。通过考察甲醇和乙腈沉淀蛋白的情况，发现乙腈沉淀蛋白比较彻底；而采用甲醇沉淀蛋白时，对提取溶液进行浓缩后仍发现有白色固体析出。因此，本实验选择乙腈作为提取溶剂。

2.2净化条件的选择

采用液相色谱-串联质谱法测定易受测试溶液背景的干扰，因此需要采取净化的方式来降低基质背景的影响。本实验分别考察了正己烷脱脂、QuEChERS和固相萃取(SPE)3种净化方式，并选择MCX、HLB、C18等不同类型的固相萃取柱进行净化效果的比较。结果显示：采用乙腈饱和的正己烷可对提取后的溶液进行有效地脱脂，且不影响回收率，同时可以降低杂质背景的干扰。采用QuEChERS(主要填料为MgSO4、C18和PSA)净化时，双氰胺和地昔尼尔的回收率较好，均大于70%，但其他化合物的回收率并不理想，仅为30%～50%。采用固相萃取柱净化时，MCX固相萃取柱对地昔尼尔、环丙氨嗪、三聚氰胺3个化合物的回收率为60%～80%，对其他2个化合物的回收率仅为30%左右；采用直接上样接收的方式进行净化时，HLB柱的净化效果好于C18柱，且使用氨化乙腈代替乙腈可明显提高洗脱效率。综合考虑以上结果，本实验采用正己烷脱脂和HLB固相萃取柱净化的方式进行前处理。

2.3液相色谱条件的优化

本实验测定的化合物极性较大，参考文献[15]选择HILIC色谱柱对其进行分析测试。考虑到酸性环境可以提高化合物的离子化效率，加入乙酸铵能够进一步改善峰形，因此本研究采用正交实验的方式，综合考察了乙腈、甲醇、0.15%甲酸水溶液、含5 mmol/L乙酸铵的0.15%甲酸水溶液为定容溶液和流动相时的分离效率、谱峰峰形和信号强度。结果显示：流动相为乙腈和0.15%甲酸水溶液时(梯度洗脱)，谱峰的峰形和强度较好，加入5 mmol/L乙酸铵可明显提高各化合物的信号强度，其中地昔尼尔的强度可提高近50倍。地昔尼尔谱峰峰形受外界因素的影响较大，当定容溶液与流动相初始溶液一致时，谱峰峰形较好，二者不一致时则会出现“分叉”峰。因此，本实验选择乙腈和含5 mmol/L乙酸铵的0.15%甲酸水溶液作为流动相和定容溶液，该条件下，各化合物在脱脂牛奶中的分离出峰情况示于图1。

2.4质谱测定条件的优化

在正离子模式下，采用流动注射的方式对待测化合物的标准溶液进行稀释和母离子全扫描，以确定分子离子峰；再分别以待测化合物的分子离子为母离子，对其子离子进行全扫描，各化合物主要的子离子及可能的碎片信息示于图2。按照欧盟EC/657指令进行化合物定量确证必须满足4个识别点的要求(母离子1点，特征子离子1.5点/个)，选择2个特征子离子，其中以信噪比高、峰形好、干扰小的离子对作为定量离子对。以多反应监测正离子模式优化质谱参数，结果列于表1。

图1　脱脂牛奶中5种化合物的色谱图

2.5线性关系和方法定量限

采用液相色谱-串联质谱法进行定量测定时，基质通常具有增强或抑制效应。本实验考察了溶剂线性和空白提取基质溶液加标线性工作曲线定量计算的情况，浓度相当于样品中含有0、50、100、200、400 μg/kg的标准品(其中三聚氰胺-15N3的浓度为50 μg/L)。结果显示，两种工作曲线定量结果的偏差大于15%，说明存在明显的基质抑制效应。因此，采用添加同位素内标物和空白样品提取液稀释配制标准工作溶液两种方式相结合来减弱离子化时的基质效应，减小定量结果的偏差。

以待测物质量浓度x(μg/kg)为横坐标，以标准品与同位素内标物峰面积比值y为纵坐标(外标法以谱峰面积为纵坐标)，绘制各药物混合标准溶液工作曲线，得到线性方程，其线性相关系数R2>0.991。牛奶样品中各药物的方法定量限(S/N=10)为：地昔尼尔0.5 μg/kg、双氰胺2.5 μg/kg、缩二脲20 μg/kg、环丙氨嗪5 μg/kg和三聚氰胺15 μg/kg；奶粉样品中各药物的方法定量限(S/N=10)为：地昔尼尔8 μg/kg、双氰胺35 μg/kg、缩二脲50 μg/kg、环丙氨嗪40 μg/kg和三聚氰胺50 μg/kg。向空白牛奶和奶粉中添加各化合物的混合标准溶液，添加水平为50 μg/kg，测得的脱脂牛奶总离子流图示于图3。

图2　5种化合物的质谱图和可能的结构式

2.6回收率及精密度实验

选用不含各类化合物的脱脂牛奶、全脂牛奶、脱脂奶粉、全脂奶粉和婴幼儿配方奶粉进行3个浓度水平(50、100和200 μg/kg)的添加回收实验，每个浓度水平取6个平行样品，实验结果列于表2。其中，地昔尼尔、双氰胺、缩二脲和环丙氨嗪采用外标法定量，三聚氰胺采用内标法定量，方法的总体回收率为72.4%～102.8%，整体相对标准偏差为1.3%～12.3%。

图3　脱脂牛奶中各化合物MRM总离子流图(添加浓度50 μg/kg)

化合物添加水平/(μg/kg)脱脂牛奶脱脂奶粉全脂牛奶全脂奶粉婴幼儿配方奶粉回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%回收率/%RSD/%地昔尼尔5089.97.686.28.692.65.287.13.681.85.210094.14.395.78.285.92.784.37.785.76.520087.69.4102.24.596.12.896.17.296.06.3双氰胺5088.36.293.27.596.59.587.24.383.68.810093.04.883.49.293.55.081.98.686.35.920099.74.093.46.788.43.995.27.697.711.0缩二脲5083.54.479.76.893.97.072.47.387.89.710099.67.995.611.295.87.381.09.591.77.120096.38.190.46.685.74.190.83.683.77.6环丙氨嗪5080.28.091.27.978.56.482.94.292.310.610096.45.780.56.297.99.990.31.399.811.620093.44.2101.42.784.66.287.38.781.012.3三聚氰胺5098.47.6102.83.5101.88.393.84.6100.03.3100100.46.9102.24.795.96.396.05.299.84.020094.43.9101.65.498.94.298.63.498.53.5

2.7实际样品分析

应用该方法对55个不同品牌和批次的进出口脱脂牛奶、全脂牛奶、脱脂奶粉、全脂奶粉和婴幼儿配方奶粉样品进行测定，有2个批次的全脂牛奶中含有三聚氰胺，含量分别为0.14 mg/kg和0.20 mg/kg。同时，采用GB/T 22388—2008方法对这2个批次的全脂牛奶进行测定，也检出了三聚氰胺，含量分别为0.16 mg/kg和0.19 mg/kg，二者基本一致。

3结论

建立了LC-MS/MS法同时测定牛奶和奶粉中5种非蛋白含氮化合物。样品经乙腈沉淀蛋白和提取，正己烷脱脂，HLB固相萃取净化后，采用LC-MS/MS法测定，外标法和同位素内标稀释法定量，方法的总体回收率为72.4%～102.8%，相对标准偏差为1.3%～12.3%。该方法操作简单、选择性好、定量限能满足目前国内外的相关要求。应用该方法对55批次牛奶和奶粉样品中5种非蛋白含氮化合物的含量情况进行测定，其中阳性样品的测定结果与国家标准方法测定的结果一致。

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收稿日期：2015-09-10;修回日期：2015-10-28

基金项目：浙江出入境检验检疫局科研项目(ZK201428)资助

作者简介：侯建波(1983—)，男(满族)，内蒙古人，高级工程师，从事食品中药物残留检测研究。E-mail: houjb@ziq.gov.cn

中图分类号：O657.63

文献标志码：A

文章编号：1004-2997(2016)04-0336-07

doi：10.7538/zpxb.youxian.2016.0022

Simultaneous Determination of 5 Nitrogen-Rich Adulterants in Milk and Powdered Milk by LC-MS/MS

HOU Jian-bo1,2, XIE Wen1,2, LI Jie3, LU Shun3, ZHU Ze-long3, YAO Bin-bin3

(1.TheTechnicalCenterofZhejiangEntryExitInspectionandQuarantineBureau,Hangzhou310016,China;2.ZhejiangAcademyofScienceandTechnologyforInspectionandQuarantine,Hangzhou310016,China;3.ZhejiangLeadProductTechnicCo.Ltd.,Hangzhou310016,China)

Abstract:A method of liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) was developed for the determination of five nitrogen-rich adulterants (dicyclanil, dicyandiamide, biuret, cyromazine, melamine) in milk and powdered milk samples. These compounds were potential to be used in economic adulteration to enhance the nitrogen content in milk products. The protein of sample was precipitated, and the extracts were dissolved and distilled with acetonitrile. The supernatant solution was extracted with n-hexane to remove the fat, and then cleaned up with SPE HLB cartridges. The quantitative detection was performed on LC-MS/MS by multiple reaction monitoring (MRM) mode under positive electrospray ionization (ESI+). Isotopes dilution internal standard method (melamine) or external standard method (dicyclanil, dicyandiamide, biuret and cyromazine) was used to determine the residue contents in samples. The limits of quantification (LOQs, S/N=10) are dicyclanil (0.5 μg/kg), dicyandiamide (2.5 μg/kg), biuret (20 μg/kg), cyromazine (5 μg/kg), melamine (15 μg/kg) for milk samples and dicyclanil (8 μg/kg), dicyandiamide (35 μg/kg), biuret (50 μg/kg), cyromazine (40 μg/kg), melamine (50 μg/kg) for powered milk samples. Single-laboratory method validation data are determined, the calibration standard curves concentration are 0, 50, 100, 200, 400 μg/kg and the correlation coefficients are more than 0.991. The average recovery is 72.4%-102.8%, and the relative standard deviation (RSD) is 1.3%-12.3%. The residues of 5 compounds in 55 batches of milk and milk powder samples are determined by LC-MS/MS, and the results are consistent with the national standard method (GB/T 22388—2008). This method is suitable for determination and confirmation of these compounds and provides a convenient, rapid and effective approach to proactively combat economically motivated adulteration in milk and powdered milk sample.

Key words：milk; powdered milk; liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); nitrogen-rich adulterants; simultaneous determination

网络出版时间：2016-03-28；网络出版地址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/11.2979.TH.20160328.1443.002.html