甲鱼养殖场抗污螺旋藻的分离及生长特性研究

罗金飞，蒋路平，朱建龙，朱杰胄

(1.嘉兴市水产技术推广总站，浙江嘉兴　314050；2.嘉兴中清环保科技有限公司，浙江嘉兴　314006；3.嘉兴市海洋与渔业环境监测站，浙江嘉兴　314050)



甲鱼养殖场抗污螺旋藻的分离及生长特性研究

罗金飞1，蒋路平1，朱建龙2，朱杰胄3

(1.嘉兴市水产技术推广总站，浙江嘉兴314050；2.嘉兴中清环保科技有限公司，浙江嘉兴314006；3.嘉兴市海洋与渔业环境监测站，浙江嘉兴314050)

摘要：从嘉兴市某温室甲鱼养殖场废水储存池中分离出1株螺旋藻JXSC-S1。通过与典型钝顶螺旋藻品系进行比较，确定该藻种的藻丝颜色、形状、螺距、螺宽、细胞大小等符合钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)的形态特征。在Zarrouk培养基中，JXSC-S1的生长速率为1.64/d，生长代时为13.96 h，与典型钝顶螺旋藻种S6、S2相似，高于Ns-90020。在温室甲鱼废水中，JXSC-S1的生长速率、外观颜色和藻丝特征都与在Zarrouk培养基中相差不大，远高于S6(0.33/d)，而Ns-90020基本不长，S2死亡。上述结果表明，该本地藻种JXSC-S1可以在温室甲鱼废水中快速生长，在用温室甲鱼废水代替昂贵的Zarrouk培养基高效规模生产优质饲料蛋白方面有很大应用潜力。

关键词：钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)；形态鉴定；生长特性；藻丝性状

螺旋藻(Spirulina)含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素和生物活性物质，对提高生物体免疫力，防治多种疾病有辅助作用[1]。螺旋藻生长繁殖快，光合效率高，近年来国内外规模养殖较多。规模养殖中需要向水中投加小苏打和氮磷等营养盐。上述营养盐价格贵且用量大，导致螺旋藻的生产成本较高，其中培养基成本一般占总生产成本的20%～30%[2]。

利用温室甲鱼废水培养钝顶螺旋藻(Spirulinaplatensis)，不仅可以实现温室甲鱼废水的脱氮除磷，还可以降低螺旋藻的培养成本，收获藻体作为饲料，解决市场上饲料级螺旋藻供应不足的难题。与纯培养相比，螺旋藻在废水中的培养生长慢，产量低，性状不良，粗蛋白含量不高[4]。为解决上述问题，筛选高耐污藻种是关键。Anaga等[5]在化肥厂废水中分离到一株钝顶螺旋藻并培养，7 d后生长(0.95/d)明显优于其它螺旋藻。Kosaric等[6]从废水处理厂的二级废水池中分离一株螺旋藻，在温度30℃，光照4000 Lx下培养，与其它规模养殖的螺旋藻相比，该藻种生长最快(0.77/d)，粗蛋白含量最高(50.5%)。耿亚红等[7]从生活污水中分离出一种螺旋藻，与一般螺旋藻生长生理特性显著不同，在生活污水中的生长速率达到1.09/d，明显快于其它一般螺旋藻。阮榕生等[8]在市政废水中分离到一株耐污螺旋藻，生长速率平均达到0.82/d，明显快于一般螺旋藻(FACHB439、FACHB350、FACHB792)在市政废水中生长速率。

本研究旨在从温室甲鱼废水中分离出生长速度快、产量高、抗逆性和适应性强、藻丝性状优良、粗蛋白高的钝顶螺旋藻藻种，为钝顶螺旋藻的温室甲鱼废水培养提供优质藻种。

1材料与方法

1.1仪器与材料

BX51荧光数码显微镜(Olympus公司)；GZP450光照培养箱、DHG-9240干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)；722s可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；Sens ION+便携式pH计(HACH公司)；AL204-1C精密电子天平(METTLER TOLEDO公司)；UV4802紫外分光光度计(尤尼科仪器公司)；SD-9011色度计(上海昕瑞公司)。

本地分离藻种JXSC-S1取自浙江省嘉兴市某温室甲鱼养殖场废水储存池。Ns-90020分离自云南滇池，购自中科院武汉植物所； S6和S2分别分离自河北省黄骅县沿海和海南澄迈县福山湖，购自武汉水生所。Ns-90020、S6、S2是国内螺旋藻规模化养殖中常用的钝顶螺旋藻品系。Ns-90020被广东海大养殖公司使用，S2被福建省神六养殖公司使用，S6被山东海福生物工程有限公司使用。

温室甲鱼废水取自嘉兴某规模化温室甲鱼养殖场废水池排水，经自然沉淀、好氧生物处理和高级氧化脱色后，再经0.45 μm滤膜过滤后获得。水质如下：COD为(280±70)mg/L，氨氮为(2.5±0.5)mg/L，TN为(1200±250)mg/L，TP为(45±10)mg/L，总碱度为(8000±2000)mg/L，色度为(150±50)倍，pH为(8.5±0.5)。

1.2实验方法

1.2.1本地藻种JXSC-S1的分离及其与典型钝顶螺旋藻品系的外观比较

各品系藻液用Milli-Q超纯水清洗后摇匀，用吸管取约0.1 mL置于载玻片中央，盖上盖玻片，显微镜下(目镜10×，物镜20×)观察并拍照。每个样品重复3次。

1.2.2各品系藻种在Zarrouk培养基中的生长特性比较

250 mL锥形瓶中盛放90 mL Zarrouk培养液[9]，分别接种各品系对数生长期的藻液10 mL，使接种密度D560约为0.2。用封口膜封口，放置于温度(25±2)℃，光照(6000±2000) lx，光暗比12 h∶12 h的光照培养箱中培养10d，每天摇动混匀1次，测试D560，显微镜下(目镜10×，物镜20×)观察藻细胞形态。培养最后1d称藻细胞干重，测试粗蛋白含量。每组培养试验设3个平行样。最大比生长速率K(/d)、生长代时G(h)用式按文献计算[10]。

1.2.3各品系藻种在温室甲鱼废水中的生长特性比较

用1.1节中的温室甲鱼废水(TBW)代替Zarrouk培养基，其余试验方法同1.2.2节。每组培养试验设3个平行样。

1.2.4JXSC-S1和S6品系在温室甲鱼废水连续批次培养中的生长特性比较

分别使用1.1节中的温室甲鱼废水原液、2倍稀释液和5倍稀释液，代替Zarrouk培养基，接种本地藻种和S6品系在光照培养箱中连续培养19 d。鉴于目前螺旋藻规模培养普遍采用连续批次培养、批次换水模式，以有效补充氮磷等营养并促进细菌和有毒代谢物质及时排出，所以本实验在19 d的培养期间也进行了批次换水：0～6 d为第1个培养周期，第7d藻密度达到D560=0.8可采收藻，新添加1/3甲鱼废水；第7～14 d为第2个培养周期，第14天当D560=0.8时采收藻，新添加2/3甲鱼废水；第14～19 d为第3个培养周期，第19 d当D560=0.8时采收藻，采收后滤液排掉。初始接种密度D560约为0.05，其余条件同1.2.2节。

1.3分析测试方法

螺旋藻细胞数用血球计数板计数[11]；D560采用722s可见分光光度计在560 nm下测定[12]；上浮率(%)为藻分层后上下层D560比值[13]；螺旋藻干重测定时先把一定容积的藻液用400目滤布过滤，之后在60℃下烘4 h，计算单位体积藻液烘干后的干重[14]，得出产量g/(m2·d)；粗蛋白采用考马斯亮蓝法测定[11]，得出粗蛋白含量(%)。显著差异采用p值检验分析。常规水质分析参照《水和废水监测分析方法》第四版[15]。

2结果与分析

2.1JXSC-S1的分离及其与典型螺旋藻品系的形态特征比较

JXSC-S1的基本形态特征及其与其他螺旋藻品系的比较结果如表1所示。JXSC-S1的藻丝呈蓝绿色，细胞横壁处略缩缢，螺旋宽29～30 μm，螺距46～48 μm，与S6接近，比S2略长，比Ns-90020略短；藻丝末端渐窄不明显，与S6相似，但区别于Ns-90020和S2，后两者藻丝末端渐窄明显；末端细胞都呈宽圆，藻丝细胞宽3～4 μm，长4～5 μm，细胞大小与S6和S2接近，但比Ns-90020细胞小。以上形态特征符合钝顶螺旋藻的基本特征，而与极大螺旋藻(S.maxima)和盐泽螺旋藻(S.subsalsa)的基本特征差异很大。因此，通过形态特征判定本地分离种JXSC-SP1为S.platensis。

表1　本地螺旋藻种与典型螺旋藻品系的形态特征比较

2.2JXSC-S1与典型品系钝顶螺旋藻种在Zarrouk和TBW培养基中的生长特性比较研究

JXSC-S1与典型钝顶螺旋藻种Ns-90020、S6、S2在Zarrouk培养基中的生长曲线如图1所示。4个品系都经过2 d的停滞期后迅速进入指数增长期，第9 d后进入平衡期。本地分离藻种JXSC-S1生长速率与S6(p:0.255)、S2(p:0.184)接近，远高于Ns-90020(p:0.018)。从温室甲鱼废水中的生长特性曲线可以看出，培养10天后，Ns-90020和S2基本未增殖；S6随时间延长有所增殖，但增殖速度远低于本地藻种JXSC-S1；本地分离藻种JXSC-S1数量显著增长，D560达到4.0以上。通过比较，发现本地分离藻种JXSC-S1在温室甲鱼废水中的生长曲线与Zarrouk培养基差别不大，但其它品系的钝顶螺旋藻在废水中培养时生长均明显受到抑制。由此说明，本地藻种JXSC-S1能适应废水的培养环境，这可能与藻在原生长地的长期驯化有关，也可能与藻种有关。

基于图1计算各品系钝顶螺旋藻在Zarrouk培养基中的生长指标，如表2所示。同时与文献报道中[14]国内外规模养殖普遍使用的钝顶螺旋藻品系在Zarrouk培养基中的生长指标数据相比较。表2中非洲乍得品系为国外(如以色列Seambiotic公司、墨西哥Originoil公司)规模养殖所普遍采用，FACHB439(分离自云南程海湖，购自中国科学院水生生物研究所)为国内南方螺旋藻养殖公司(如云南绿A公司、广东华粤生物公司和海南海之源养殖公司)所常用，S1品系(分离自内蒙古鄂尔多斯某盐碱湖)为鄂尔多斯螺旋藻养殖园区所使用。本地藻种JXSC-S1的最大比生长速率与生长代时分别为1.64/d、13.96 h，与S1(p:0.193)、S6(p:0.235)接近，略低和略慢于S2(p:0.342)，但远高和远快于Ns-90020(p:0.017)、非洲乍得(p:0.029)、FACHB439(p:0.011)。本地分离藻种具有气浮性，气浮率与其它几个差异不大。本地分离藻种在Zarrouk培养中产量最高可达42 g/(m2·d)，明显高于其它几个品系(Ns-90020(p:0.014),S6(p:0.026),S2(p:0.012),Chad(p:0.014),FACHB439(p:0.036)and S1(p:0.029))；藻种粗蛋白含量62.8%±6%，低于Ns-90020(p:0.041)，高于S2(p:0.123)和S6(p:0.135)，与非洲乍得(p:0.581)、FACHB439(p:0.274)和S1(p:0.191),差别不大。表2中粗蛋白含量与生长速率呈负相关(k平均值：-13.8)，这与文献报道相一致。殷春涛等[18]通过实验发现不同钝顶螺旋藻品系蛋白同化能力与细胞分裂速度有关，分裂越慢，代时越长，蛋白同化能力相对较强，相同生长周期积累蛋白量越大。

图1　各钝顶螺旋藻品系在Zarrouk培养基和温室甲鱼废水(TBW)中的生长曲线图

表2　各品系在Zarrouk培养基中的生长指标

基于图3计算各品系钝顶螺旋藻在温室甲鱼废水中的生长指标，如表3所示。本地分离藻种的最大比生长速率与生长代时分别为1.55/d和14.15 h，与Zarrouk培养相差不大，远高和远快于其它三个品系 (Ns-90020,p:0.028;S6,p :0.042;S2,p:0.034)。

表3　各品系钝顶螺旋藻在温室甲鱼废水培养中的生长指标

4种钝顶螺旋藻在温室甲鱼废水中培养10 d的外观颜色与藻丝性状如图2所示。本地分离藻种JXSC-S1在温室甲鱼废水中的外观颜色和藻丝特征与Zarrouk培养基中差别不大。在废水中仍然呈蓝绿色，平均螺旋数=10个，藻丝较长。而其它3个品系的颜色和藻丝形态发生明显变化。废水中的S6呈绿色，NS-90020呈淡绿色， S2呈黄色。S6虽然生长但螺旋数少、螺距大而松弛；Ns-90020外观颜色虽然与接种时一样，但是部分藻种变直，失去螺旋； S2藻丝断裂严重，标志基本死亡。

S2、S6和Ns-90020的螺旋藻体变松变直甚至断裂，这可能与甲鱼废水的环境不利于生长有关。胡鸿钧等[18-19]研究认为，螺旋藻藻丝体在通常情况下是呈规则的螺旋形，但在外界环境条件改变或不良环境等条件的胁迫下，藻丝体会从正常螺旋形转变为卷曲度不同的螺旋甚至是直线形，这直接影响到藻丝体在营养学、生理学及养殖特性上也会发生相应的改变。藻丝体变异为直线形，会导致藻种退化、营养摄取效率降低，从而造成产量急剧下降、质量变差、藻体难于采收及易受颤藻污染等一系列严重问题。

图2　不同钝顶螺旋藻品系在温室甲鱼废水中培养的外观颜色及形态

2.3JXSC-S1和S6在温室甲鱼废水中多批次培养的生长情况比较

分别用温室甲鱼废水原液、2倍稀释液和5倍稀释液培养两种螺旋藻，生长曲线如图3所示。第一个培养周期中，各稀释浓度的废水中，接种1d后2个品系螺旋藻种吸光度均有所下降，随着时间的延长，螺旋藻逐渐被驯化，适应了温室甲鱼废水水质环境，3 d后开始出现对数增长，7 d后本地品系JXSC-S1在废水原液、2倍稀释液、5倍稀释液和S6 5倍稀释液中D560达到0.8以上，最大比生长速率分别为1.49、1.42、1.04、0.82/d，但S6在废水原液和2倍稀释液中生长慢，D560均未达到0.8，JXSC-S1在废水原液和2倍稀释液生长差异不大，但好于JXSC-S1 5倍稀释液和S6 5倍稀释液培养；第2个培养周期中，本地品系JXSC-S1在废水原液、2倍稀释液、5倍稀释液和S6 5倍稀释液中D560均达到0.8以上，最大比生长速率分别为1.18、1.12、0.78、0.73/d，均较第一周期慢；第3个培养周期中，生长都有明显减缓，除S6 5倍稀释液外，其它均达到0.8以上。JXSC-S1每个周期培养均达到0.8，可以看出这个藻种应用于废水连续批次培养可行的，但随每个周期生长变慢，可能细菌和有毒代谢物质抑制。

图3　本地品系JXSC-S1和S6在不同废水稀释液中

实验结果表明，本地品系JXSC-S1对于本地温室甲鱼废水的适应性优于S6品系螺旋藻。螺旋藻通过光合作用将废水中N、P等营养物质转化成自身有机物。歇尔福德耐受定律表明，微藻在生长过程中对所有的环境影响因素均有其特定的承受范围，超过其耐受范围的环境条件会抑制微藻的光合作用[20]；经预处理的废水COD、色度等对螺旋藻种生长有明显抑制作用的因子均降至一定水平(螺旋藻可承受范围)，由此判断影响螺旋藻生长的主要限制因子是氨氮浓度[14]。

本地品系JXSC-S1的增长速率随废水稀释倍数的增加而减小，而S6品系螺旋藻则相反，生长速率随废水稀释倍数增加而增大。这可能是因为本地藻种JXSC-S1对废水中氨氮的浓度耐受性较高，废水原液中氨氮不对其正常生长产生抑制，培养基中营养成分含量是决定其生长速率的关键因素；而对于S6品系螺旋藻，废水原液中氨氮有抑制作用，需要稀释才能降低抑制。

3结论和讨论

(1)从本地温室甲鱼废水池中分离得到高耐污螺旋藻种，藻丝颜色，螺宽、螺距、末端细胞特征、细胞长宽等形态特征符合钝顶螺旋藻基本特征。

(2)本地分离藻种JXSC-S1在Zarrouk培养基中的生长速率(1.64/d)和生长代时(13.96 h)与S6、S2相似，但在废水中的生长速率(1.55/d)远优于其它典型钝顶螺旋藻。能够在废水原液中连续培养并快速生长，生长速率与Zarrouk培养基中的生长速率相同，外观颜色和藻丝特征差别不大，意味着该本地藻种在用温室甲鱼废水代替昂贵的Zarrouk培养基大规模生产优质饲料蛋白方面有很大应用潜力。

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(责任编辑：张潇峮)

收稿日期：2015-05-18；

修订日期：2015-11-24

第一作者简介：罗金飞，男，助理研究员，主要研究方向为水产养殖废水资源化利用研究。E-mail:wsljf@126.com 通讯作者：蒋路平。E-mail:jlp196209@sina.com

中图分类号：S963.21

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)04-0077-06

A Spirulina sp.isolated from greenhouse turtle breeding wastewater and its growth dynamics

LUO Jin-fei1,JIANG Lu-ping1,ZHU Jian-long2,ZHU Jie-zhou3

(1.FisheryTechnologyExtensionCenterofJiaxingcity,Jiaxing314050,Zejiang,China;2.EarthtechEnviromentalTechnologyCo.,Ltd.,JiaXing,Jiaxing314006,Zejiang,China;3.MarineEnvironmentMonitoringStationofJiaxingCity,Jiaxing314050,Zejiang,China)

Abstract：Spirulina sp.JXSC-S1 was isolated from a turtle-breeding wastewater pool in greenheuse in Jiaxing.Morphological studies revealed that the color,shape,spiral pitch,spiral wide and cell size of the strain fit the typical morphological characteristics of Spirulina platensis.Growth dynamics of the strain were then studied in both Zarrouk medium and turtle-breeding wastewater(TBW) in greenhouse,and the results were compared with those of several typical S.platensis strains S6,S2 and Ns-90020.All the strains grew well in Zarrouk medium.The strain JXSC-S1 demonstrated a maximum growth rate of 1.64/d,similar to that of S6 and S2,while faster than Ns-90020.When the culture medium was changed to TBW,all the strains grew seldomly except for the strain JXSC-S1 which grew fast and remained almost the same maximum growth rate as in Zarrouk medium.Rich in protein and bioactive mateirials,Spirulina sp.JXSC-S1 might be used for recycling nitrogen and phosphorus from TBW.

Key words：Spirulina platensis;morphological identification;growth characteristics;filaments

资助项目：浙江省科技项目(2015C32115) ：甲鱼养殖废水生态处理和循环再利用的关键技术研究