微卫星QTL标记分析豫选黄河鲤群体遗传结构及生长性状相关性

顾　颖,鲁翠云,张　芹,李　超,屈长义,王兆平,程　磊,孙效文,冯建新

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨　150070；2.河南省水产科学研究院,郑州　450044)



微卫星QTL标记分析豫选黄河鲤群体遗传结构及生长性状相关性

顾颖1,鲁翠云1,张芹2,李超1,屈长义2,王兆平2,程磊1,孙效文1,冯建新2

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,哈尔滨150070；2.河南省水产科学研究院,郑州450044)

摘要：用35个镜鲤微卫星QTL标记评估了豫选黄河鲤(Cyprinus carpio var. haematopterus)群体的遗传结构,并评估了不同基因型与生长性状(体重、体长、体高和体厚)的相关性,筛选了在群体中具有性状优势的基因型。35个微卫星标记在288个豫选黄河鲤个体中的扩增结果显示,各标记等位基因数为3～13,平均每个标记6.828 6个;平均有效等位基因数为4.520 8;平均观测杂合度为0.603 0;平均期望杂合度为0.701 9;平均多态信息含量为0.665 6,群体整体处于高度多态水平(PIC>0.5)。利用SPSS19.0的GLM模型分析标记与性状的相关性,共17个微卫星标记与性状表现出不同程度的相关性,其中HLJ2456、HLJ2387和CA1677 3个标记与相应的性状相关性达极显著水平。用Duncan氏多重比较找到了每个微卫星标记具有生长性状优势的基因型,下一步可根据优势基因型指导豫选黄河鲤家系配组,开展基于QTL结果的分子聚合育种研究。

关键词：豫选黄河鲤(Cyprinus carpio var. haematopterus);微卫星;遗传多样性;生长性状;相关性

黄河鲤(Cyprinuscarpiovar.haematopterus)是我国“四大淡水名鱼”之一,因其形状、色泽及肉质均优于其他水体的鲤鱼而著称。但上世纪后半叶以来,受水质污染、过度捕捞及黄河断流等影响,天然水域中黄河鲤资源遭到严重破坏,且出现种质混杂的状况,野生黄河鲤濒临灭绝[1]。为了拯救黄河鲤这一名贵鱼种,河南省水产科学研究院历经20余年由黄河河道野生黄河鲤系统选育8代后,育成黄河鲤良种—豫选黄河鲤(品种登记号：GS01-001-2004),恢复了黄河鲤“金鳞赤尾,体形梭长,肉质细嫩鲜美”的特征。该品种生长速度比选育前提高36.2%以上[2]。为了保持豫选黄河鲤资源,使其更快更好生长,需要对其进行进一步选育。近年来,随着分子标记技术的发展,通过分子标记进行辅助选择为鲤种质资源的改良提供有效途径。

对于鲤QTL资源的发掘,已经积累了很多,尤其近年来,利用遗传图谱定位及单标记回归分析获得的与体重和体长等生长性状相关的标记达上百个之多[3-9],且这些标记多为共显性,适用于标记指导育种实践。但以上研究多采用镜鲤及一些杂交鲤家系或群体,鉴于鲤不同品种、不同群体间的QTL标记有共性也有差异,因此现有的QTL标记在豫选黄河鲤繁殖群体中是否适用,还需要进一步评估。本研究选用35个在镜鲤家系中获得的生长性状QTL标记分析豫选黄河鲤大样本养殖群体,评估群体遗传结构及标记基因型与生长性状的相关性,以期为豫选黄河鲤群体的遗传结构优化及开展基于QTL结果的分子聚合育种研究提供基础数据。

1材料和方法

1.1实验鱼及QTL标记的选择

2014年10月于河南省水产科学研究院豫选黄河鲤养殖示范基地采集同池饲养的豫选黄河鲤2龄成鱼288尾,测量体重(BW)、体长(BL)、体高(BH)及体厚(BT)等表型性状,并剪取部分鳍条组织置于滤纸干燥保存[10]。本研究从鲁翠云等[11]筛选的镜鲤生长性状QTL标记中选取了48个对豫选黄河鲤群体进行检测。

1.2基因组DNA的提取及PCR扩增

剪取约0.1 g鳍条于400 μL的裂解液(10 mmol/L EDTA,pH 8.0;200 μg/mL 蛋白酶K;0.5%的十二烷基肌氨酸钠)中,55 ℃ 温育2～3 h,酚、氯仿、异戊醇(体积比为25∶24∶1)混合液抽提3次,无水乙醇沉淀,自然干燥后溶解于1/10 TE中,1%的琼脂糖检测DNA的质量及估测浓度。

建立15 μL反应体系,包括PCR混合缓冲液11 μL(10 mmol/L Tris-Cl (pH8.0),50 mmol/L KCl,2.0 mmol/L MgCl2,0.01%明胶,0.1% Tween-20,0.1% NP-40,dNTP各2 mmol/L),上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,模板DNA (50 ng/μL)1 μL,TaqDNA聚合酶(Promega)1 U,补无菌水到15 μL。PCR反应程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,25～27个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。Gel-Pro Analyzer 4.5软件判读基因型,确定等位基因大小。

1.3数据统计与分析

建立基因型数据库,采用自主开发的“鱼类种质资源遗传分析平台(专利号:ZL200710144749.3)”将0、1矩阵转化为PopGene(Version 3.2)格式。运行PopGene(Version 3.2)软件获得各微卫星标记的遗传多样性参数,包括等位基因数(observed number of alleles,Na)、有效等位基因数(effective number of alleles,Ne)、基因型数(number of genotypes,Ng)、观测杂合度(observed heterozygosity,Ho)、期望杂合度(expected heterozygosity,He)等。

通过SPSS19.0软件的GLM模型分析标记各基因型与体重、体长、体高和体厚性状的相关性。以某标记的某基因型对应的表型性状均值显著高于其他基因型的表型均值,并高于总体均值为优势基因型的判定标准。用Duncan氏多重比较找到了每个微卫星标记具有生长性状优势的基因型。对于一些标记中某些基因型出现频率太少,缺少分析价值,因此在实际统计分析中,每种基因型至少有3次观察值才被考虑。

2结果与分析

2.1表型分析

对体重、体长、体高和体厚性状表型值进行统计分析,所有性状都显示出连续变异的特点,是典型的数量性状。Shapiro-Wilk正态分布检验显示,各性状P值均大于0.05,符合正态分布;Pearson相关性检验显示,4个生长性状间具有不同程度的相关性(表1)。

表1　豫选黄河鲤生长性状正态分布检测

2.2扩增结果

用48个微卫星标记对豫选黄河鲤进行多态性筛选,其中35个(72.92%)标记扩增出稳定、清晰的DNA条带,并在个体间表现出不同程度的多态性,2个标记为单态,11个标记条带不清晰或表现为三条以上的条带,不适合二倍体鲤的群体遗传分析。

35个标记在288个豫选黄河鲤个体中的扩增结果显示,各标记等位基因数为3～13,平均为6.828 6;观测杂合度为0.131 9～0.964 0;期望杂合度为0.162 9～0.899 3。多态信息含量为0.153 5～0.888 8,平均为0.665 6,群体整体处于高度多态水平(PIC>0.5)(表2)。Hardy-Weinberg平衡检测显示,4个位点显著偏离平衡(P<0.05),22个位点极显著偏离平衡(P<0.01)。

表2　豫选黄河鲤群体在35个微卫星位点的遗传多样性参数

续表2

2.3标记与各个性状相关性分析

共有17个微卫星位点与不同性状表现出不同程度的相关性,其中HLJ2456、HLJ2387、CA1677 3个标记与相应的性状相关性达极显著水平(P<0.01)。另外,CA1812等7个标记仅与1个性状相关;CA724等5个标记与2个性状相关;HLJ2456等4个标记与3个性状相关;CA1677与4个性状都显著相关,且与体重、体长和体高3个性状的相关性均达到了极显著水平。详细统计结果见表3。结合鲁翠云等[11]镜鲤与建鲤生长性状共享QTL标记的结果,有9个标记(CA2377、CA724、HLJ2456、CA1677、CA1846、CA1276、HLJ3366、CA2137和HLJ3865)与豫选黄河鲤、镜鲤及建鲤生长性状均相关,为共享QTL标记。

表3　基于GLM模型的permutation检验表现为性状显著相关的标记及相关性阈值

注：a:镜鲤连锁群编号;*表示标记与性状显著相关(P<0.05);**表示标记与性状极显著相关(P<0.01)

对17个与性状显著相关的标记不同基因型对应的生长性状进行Duncan氏多重比较,由于单个标记在大群体样本获得的基因型组合较多(5～35个,表2),依据优势基因型的评定标准,仅按照基因型频率列出性状优势基因型(附表1)。标记CA1677的3个基因型CE、DD和CC在4项生长指标均表现出显著的优势,为性状优势基因型。HLJ2456的基因型EE、CF、CD、AB、AC、FF、AA和AD,CA1677的基因型CD和AE,HLJ3455的基因型HH、GG、CF、EH、JJ、GI、DG和AG,CA1846的基因型DE、CD、DG、FF、FI、CH、CF、CC和EE,HLJ3865的基因型EG、CE、FG、CG、DG、BF和BC在3项生长指标表现出显著的优势,为性状优势基因型。其余基因型在1个或2个生长指标表现出显著的优势,为性状优势基因型。

在分子育种中,优势基因型在育种群体中的分布频率决定了在一定检测范围内是否能够获得目标个体。本研究在17个生长相关标记上共获得175个性状优势基因型,其中标记CA2377的基因型CC、CA724的基因型DD、HLJ2456的基因型CF、HLJ3460的基因型FF、HLJ3289的基因型BB、HLJ2387的基因型DE、CA1677的基因型CE和CC、HLJ2783的基因型CF、CA2278的基因型EE、HLJ3455的基因型HH、CA1846的基因型CD、CA1276的基因型CE、HLJ3366的基因型BD、CA2137的基因型GG和HH、HLJ3865的基因型FG、HLJ3770的基因型CD等基因型的个体在某个生长指标表现为极显著的优势(生长性状均值最大),且这些基因型出现的频率较高(0.05以上),有较高的育种价值。另外,标记CA1812的基因型AA、HLJ3455的基因型AG、CA1846的基因型EE、HLJ3366的基因型FF、CA2137的基因型FI、HLJ3770的基因型FH和HH等基因型的个体生长性状均值显著高于总体均值,但是这些基因型在育种群体中出现的频率较低(低于0.015),因此不利于后续的育种操作。

3讨论

3.1豫选黄河鲤群体的遗传多样性

豫选黄河鲤是由河南省水产科学研究院从黄河河道采捕300尾个体,选外观与黄河鲤原种一致的成熟亲鱼建立豫选黄河鲤的选育基础群,经过20余年8代系统选育,育成的黄河鲤良种。作为人工选育的群体,在多代选育过程中近交、遗传漂变和人为选择压力是难以避免的,因此评价并维持选育品种的遗传多样性对其优良性状的稳定遗传具有重要作用[13-15]。Na、Ne、Ho、He和PIC等都是反映群体遗传多样性的参数,这些参数值越大,表明群体遗传多样性越丰富。本研究选用的35个微卫星QTL标记在豫选黄河鲤群体中的各指标平均值为Na=6.828 6、Ne=4.520 8、Ho=0.603 0、He=0.701 9、PIC=0.665 6,显示遗传多样性水平较高,除Ho接近苏胜彦等[16](Ho=0.62),其余各指标均明显高于李超等[17](Na=5.809 5、Ne=3.370 6、Ho=0.589 3、He=0.657 8、PIC=0.610 8)及苏胜彦等[16](Na=5.4、Ne=2.04、Ho=0.62、He=0.47、PIC=0.42)在黄河鲤群体中的结果，也高于镜鲤繁殖群体[18](Na=4.125 0、Ne=2.540 1、Ho=0.406 8、He=0.493 4、PIC=0.484 1),表明经过了多年的人工选择,豫选黄河鲤群体仍然保留了丰富的遗传多样性,具有较大的保种潜力。这与关建义[19]利用ISSR分子标记证明人工选育群体的遗传多样性相对于野生群体尚未发生明显变化相一致,也可能与本研究的样本量大有关。

Hardy-Weinberg平衡检验结果表明,35个标记中26个(74.3%)标记显著偏离平衡(P<0.05),其中22个极显著偏离平衡(P<0.01),说明群体内的基因型频率发生了较大改变。由于豫选黄河鲤群体是一个经过长达20余年人工定向选择(体形、体色、生长速度等)的群体,它面临的选择压力较大,导致群体基因型频率发生严重偏离。

3.2微卫星QTL标记与豫选黄河鲤性状的相关分析

在鱼类育种中,分子标记应用方向之一是利用基因型与目标性状的连锁关系,将某个基因型作为选择这个性状优势品种的工具。近年来,对于鲤QTL区间及生长性状相关标记的筛选已经积累了很多,其中以镜鲤为代表发掘与生长性状相关的QTL标记达上百个之多[3～9,20-21],鉴于鲤不同品种、不同群体间的QTL标记有共性也有差异,因此现有的QTL标记在豫选黄河鲤群体中是否适用,还需要进行验证。本研究选用48个在镜鲤家系中获得的生长性状QTL标记在豫选黄河鲤群体中进行检测,有35(72.92%)个标记稳定扩增并呈现多态性,接近鲁翠云等[18]用镜鲤QTL标记在建鲤中扩增的多态比例(74.07%);高于随机选用镜鲤图谱上的标记在建鲤中扩增的多态比例(41.84%)[22]。可见QTL标记比随机标记在鲤不同品种及群体间的保守性更高。从35个QTL标记中筛选出17个与豫选黄河鲤生长性状显著相关(P<0.05)的标记,其中9个是建鲤、镜鲤和豫选黄河鲤的共享QTL标记,这些标记可能与控制生长性状的基因连锁,更应该优先应用于豫选黄河鲤、建鲤和镜鲤的分子育种。

3.3性状优势基因型的分析

鲤QTL区间及生长性状相关的标记大部分是通过对单家系等近交群体的分析获得的,由于单家系中所有个体具有相同的遗传背景,每个位点上的等位基因、基因型不超过4种,因此只需要相对较少的样本量可得到较高的检测效率。而对于一个随机交配的外交群体,每个基因座位上的等位基因较多,同一基因型的个体数偏少而使与经济性状连锁的结果产生偏差或错误[3]。而在育种过程中使用的多为混合家系的外交群体,因此通过家系分析获得与目标性状相连锁的QTL标记,再将这些标记在随机的外交群体中进行验证,是提高QTL检测效率并应用于指导育种实践的前提。

由于鱼类具有惊人的繁殖力,在分子育种中,是否能够从众多苗种中获得具有优势基因型的个体,也是需要考虑的因素。因此,优势基因型在育种群体中的分布频率也非常重要。本研究采用大样本群体288个个体,在17个生长相关QTL位点共得到175个性状优势基因型,由于等位基因数及基因型数较多致使同一基因型个体数偏少,因此在实际育种操作中既要考虑基因型的性状优势大小,还要考虑其出现频率,以便于选取最佳配组方案。如标记CA2377的基因型CC、CA724的基因型DD和HLJ2456的基因型CF等基因型的个体在某个生长指标表现为极显著的优势,且这些基因型出现的频率较高(高于0.05),便于在实际育种操作中利用这些优势基因型,故在分子标记辅助选择中有较大的育种参考价值。而标记CA1812的基因型AA、HLJ3455的基因型AG和CA1846的基因型EE等基因型的个体生长性状均值显著高于总体均值,但是这些基因型在育种群体中出现的频率较低(低于0.015),不利于后续的育种操作。对于本研究中大样本养殖群体,优势基因型数较多,这给标记辅助选择应用于育种带来了很大便利。可以选择同一微卫星位点上性状优势较大的基因型,并结合基因型频率进行选择,同时筛选出不同微卫星位点性状优势较大的复合基因型并进一步将其应用于育种实践。

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(责任编辑：张潇峮)

附表1　17个微卫星标记优势基因型个体生长性状的平均值和多重比较

续附表1

续附表1

续附表1

收稿日期：2015-11-25；

修订日期：2016-04-01

第一作者简介：顾颖(1983-),女,硕士,从事鱼类分子遗传育种研究。E-mail:guying_1983@163.com 通讯作者：孙效文。E-mail:sunxw2002@163.com;冯建新。E-mail:fnjaxn@163.com

中图分类号：S917.4

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)04-0009-10

Analysis of genetic diversity and growth traits in Cyprinus carpio var. haematopterus using microsatellite QTL markers

GU Ying1,LU Cui-yun1,ZHANG Qin2,LI Chao1,QU Chang-yi2,WANG Zhao-ping2,CHENG Lei1,SUN Xiao-wen1,FENG Jian-xin2

(1.HeilongjiangFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Harbin150070,China;2.HenanProvincialResearchInstituteofAquaculture,Zhengzhou450044,China)

Abstract：Thirty-five QTL markers in mirror carp were used to analyze the genetic diversity and the correlationship between the growth traits (body weight,body length,body height and body thickness) and genotypes in 288 Yuxuan Cyprinus carpio var. haematopterus individuals.The number of alleles per locus ranged from 3 to 13 with an average of 6.828 6.The mean observed and expected heterozygosity were 0.603 0 and 0.701 9,respectively.The mean polymorphism information content was 0.665 6.The result indicated that the population was at the high genetic diversity level (PIC>0.5).A GLM procedure in the SPSS 19.0 software was used to analyze the correlation between genotypes of these 35 microsatellite markers and growth traits.A total of 17 markers were associated with these traits,of which three markers (HLJ2456,HLJ2387,and CA1677) had a significant impact on the corresponding traits.Superior genotypes were obtained using Duncan′s multiple comparison.These QTL markers and superior genotypes for growth traits in Yuxuan C.carpio var. haematopterus will promote the growth to higher production through molecular marker-assisted breeding.

Key words：Cyprinus carpio var. haematopterus;microsatellite marker;genetic diversity;growth traits;correlation

资助项目：中国水产科学研究院基本科研业务费项目(2014A05CG01);河南省现代农业产业技术体系(S2015-10)