黔西北优质蜜环菌菌株的初步筛选

王彩云+王永+严显进

摘要：比较5株黔西北本地蜜环菌与引进的A9菌株的生长速度、生物量、菌索形态、荧光强度等生物学特性。结果发现，各菌株间存在明显差异，菌索平均生长速度依次为MHJ-3>MHJ-1=A9>MHJ-6>MHJ-7>MHJ-8，菌索平均生物量依次为MHJ-3>A9>MHJ-1>MHJ-6>MHJ-8>MHJ-7，MHJ-3在菌丝萌发速度、分枝状况、荧光强度及暗培养20 d后菌索生物量等生长特性方面均优于A9。5株本地天麻共生蜜环菌中，菌株MHJ-3活性最强、性状最优，MHJ-1菌株次之。

关键词：天麻；蜜环菌；黔西北；优质菌株；生长特性

中图分类号： Q949.329+.81 文獻标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0117-03

蜜环菌（Armillaria mellea）别称榛蘑、榛子蘑，属担子菌亚门（Basiaiomycotina）伞菌目（Agaricales）白蘑科（Trichfomataceae）蜜环菌属[1]。自1790年Vahl首次鉴定蜜环菌后，发现蜜环菌在全世界广泛存在，且能侵染600多种树木[2-4]，并导致林木根腐病，造成巨大的经济损失。但其致病性并非绝对的，有些植物被侵染后生长旺盛，如天麻（Gastrodia elata）、猪苓（Polyporus umbellatus），因此蜜环菌由于其致病性及特殊性成为国内外学者的研究热点[5-6]。此外，蜜环菌又是一类药食兼用菌，具有重要价值，其产品制剂是治疗眩晕、头痛、神经衰弱的有效药物，目前已广泛应用于临床治疗[7]；其深层发酵产物中富含多糖、必需氨基酸、倍半萜类及嘌呤类化合物等多种有效成分[8]，具有较强的增智健脑、镇痉熄风、神经调节、延缓衰老以及抗癌等药理作用[9-11]，并可增强机体免疫力，与天麻药理作用及临床疗效类似[12]。

目前由于野生天麻资源的大量采挖导致市场供求关系紧张，天麻仿野生种植成为开发市场、提高产量的重要手段。用于栽培天麻的蜜环菌经连续无性繁殖，菌种会发生严重退化，从而导致天麻的产量和天麻素含量的急剧下降[13]，黔西北地区栽培天麻所用的蜜环菌大多为引进种，且已出现菌索细、生长缓慢、易感杂、抗旱能力差等缺陷，仿野生栽培中出现菌索过细、“空窝”、菌索过早干枯等状况[14]，这些问题严重影响了天麻的产量及质量。此外，赵俊和赵杰研究表明，全国各个地区天麻种类不同且存在地域差异，跨区域引进菌种或推广存在不科学性[15]。因此，选育适宜当地种植的优良蜜环菌菌株成为天麻仿野生栽培综合配套技术研究的瓶颈，也是提高天麻产量与质量的迫切问题。本研究针对黔西北地区长期引种造成的蜜环菌菌种退化及天麻产量、质量下降等问题，比较5株本地野生蜜环菌及引进种A9的菌索生长速度、平均生物量、荧光反应强度等生物学特性，以期为黔西北地区筛选出较好的天麻伴生蜜环菌菌株，为解决蜜环菌的跨地区引种问题提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

蜜环菌MHJ-1、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8从黔西北地区野生天麻生长地长有蜜环菌的菌材上分离获得（表1），蜜环菌A9购自陕西省西乡食用菌研究所。

1.2 培养基

PDA固体培养基（200 g马铃薯、20 g 蔗糖、8 g琼脂、1 000 mL 水）、PDA半固体培养基（200 g马铃薯、20 g葡萄糖、5 g琼脂、1 000 mL水）、PDA液体培养基（200 g马铃薯、20 g葡萄糖、1 000 mL水），按常规方法制作。试管PDA斜面培养基：配制PDA培养液（200 g马铃薯、20 g蔗糖、8 g琼脂、1 000 mL 水），装入试管中达试管1/3，灭菌后，45°倾斜放置至培养基冷却。所有培养基均在101 kPa、121 ℃下灭菌 20 min。

1.3 试验方法

1.3.1 蜜环菌菌索分离 将长有蜜环菌的菌材削去外层树皮，用洗洁精清洗后于自来水下自然冲洗30 min。转移到超净工作台中，75%乙醇浸泡45 s后用无菌水冲洗5次，再用0.1% HgCl2溶液中浸泡约8 min，取出后用无菌水冲洗5次，取出置于无菌培养皿中，用无菌滤纸吸净表面水后，切成 1.0 cm×0.5 cm左右大小，置于PDA试管斜面上，每支试管放置一段时间。25 ℃暗培养，定期观察记录。

1.3.2 生长速度测定 在PDA培养皿上接种蜜环菌菌种，每皿接种量为1根长0.7 cm的成熟菌索段，在25 ℃下静置暗培养，每3 d测量每组菌索的生长速率，直至菌索停止生长，然后计算菌索平均生长速率；观察记录菌索颜色、密度、粗细、分枝数等指标，每组3次重复。

1.3.3 生物量测定 将100 mL PDA液体培养基装入250 mL三角瓶中，用封口膜封口，121 ℃灭菌20 min，冷却后挑取1块0.5 cm×0.5 cm的菌块于三角瓶中，在25 ℃下黑暗条件下振荡培养，每隔48 h观察菌丝体和菌索的形态特征。20 d后在网袋上用自来水冲洗菌索上附着的培养基，洗净后的培养物在50 ℃下烘干，冷却后称其质量，每组3次重复。

1.3.4 其他培养性状对比 在培养瓶中倒入30 mL PDA半固体培养基，并接种蜜环菌，每瓶接种1块0.5 cm×0.5 cm的菌块，接种后于25 ℃、相对湿度80%的条件下静止暗培养，每24 h观察1次生长情况，并记录菌丝萌发和菌索开始生长的时间，菌索形态、生长状况及荧光反应等生长特性。

2 结果与分析

2.1 各蜜环菌的生长速度对比

6株蜜环菌在相同生长条件下菌索平均生长速度存在差异，其中蜜环菌MHJ-3的菌索生长速度最快，平均生长速度达1.17 cm/d；其次是MHJ-1和A9，其平均生长速度均为0.95 cm/d；MHJ-6、MHJ-7次之；MHJ-8菌株平均生长速度最慢，仅为0.60 cm/d。此外，MHJ-3和MHJ-1、A9的生长速度达到显著差异，与MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的生长速度达到极显著差异；蜜环菌MHJ-1与A9在生长速度上无显著差异，与MHJ-7、MHJ-8的菌索生长速度差异极显著（表2）。

2.2 各蜜环菌的生物量对比

6株蜜环菌在25 ℃下暗培养20 d后生物量存在明显差异，其中MHJ-3的生物量最大，平均生物量达1.580 6 g，比对照菌株A9的平均生物量（1.537 6 g）高约2.6%；其他4株菌株的生物量均低于A9，其中MHJ-7的平均生物量最小，仅为0.948 6 g。此外，蜜环菌MHJ-3与A9的生物量差异显著，与MHJ-1、MHJ-6、MHJ-8、MHJ-7菌株的生物量差异极显著；对照菌株A9的生物量与MHJ-1、MHJ-6、MHJ-8、MHJ-7菌株的生物量之间存在极显著差异；MHJ-1与MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的生物量间存在极显著差异；菌株MHJ-8与MHJ-7的生物量差异不显著（表3）。

2.3 各蜜环菌的培养特征比较

6株菌株在25 ℃下培养时，各菌株菌丝萌发时间、菌索开始生長时间、菌索分枝状况及荧光反应强度等生长特性有所不同，尤其是菌索的分枝特征和荧光反应强度尤为明显（表4）。其中，蜜环菌MHJ-3的菌菌丝萌发最快，菌索粗壮且分枝多，培养过程中无黑色素产生，生长均匀，荧光反应强烈，生长特性最好。对照菌A9菌索黄白色、粗壮、分枝多，但菌索部分卷曲，且有少量黑色素产生，其活性及生长特性弱于蜜环菌MHJ-3。蜜环菌MHJ-1生长状态及活性与A9相当，虽然其菌索不及A9粗壮，但其菌索有网状分枝，且各菌索生长均匀，在培养过程中无黑色素产生，整体生长性状较优良。蜜环菌MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8在培养过程中，菌索由白色逐渐变为红棕色，且有黑色素产生，但各菌株的生长状态也有差异，MHJ-6菌索较粗、分枝多，但生长不均匀，部分卷曲；MHJ-7、MHJ-8的菌索均稍细、分枝少，生长状态及活性整体弱于对照菌A9。

3 结论与讨论

蜜环菌进行多代天麻栽培后出现明显的菌种退化与变异，如用已发生退化的菌种伴栽天麻则会导致天麻产量与品质急剧下降[16]。不科学性的跨地区引种及长期引用同样的菌种会造成天麻减产，因此本研究加大了对黔西北地区蜜环菌的筛选力度，致力于选出适合于本地种植的优良蜜环菌。

目前，筛选优良蜜环菌主要依据菌索生长速度、生物量、分枝数量、生长势、菌索的粗细、菌丝萌发和菌索产生的时间、荧光反应强度等标准[17]。本试验基于以上几点，对黔西北本地5株野生天麻共生蜜环菌和1株外来优良天麻共生蜜环菌菌株进行了研究，本地菌株MHJ-3菌索生长速度、分枝状况、菌索生物量、荧光反应强度等特性均强于A9，为所有筛选菌株中表现最突出的菌株。菌株MHJ-1除生物量弱于A9外，生长速度等指标均与A9基本持平，其余3株蜜环菌菌株的菌索平均生长速度、平均生物量、荧光强度等实验室生理性状指标均弱于A9。从基本试验性状来看，5株本地蜜环菌中，MHJ-3菌株的活性最强、性状最优，MHJ-1次之。

大量研究表明，蜜环菌不同菌株对天麻产量会产生不同的影响[18]，且不同的蜜环菌-天麻组合对天麻素含量有显著影响[15]，在实际生产中，培养蜜环菌主要是为了伴栽天麻，因而蜜环菌的品质直接影响到天麻的产量和品质。由于不同的地理区域分布着不同种类的蜜环菌[15]，且蜜环菌种类繁多，因此并非所有的蜜环菌都与黔西北地区天麻具有良好的共生关系。而本地蜜环菌MHJ-3、MHJ-1菌株与黔西北地区天麻是否具有良好的共生关系、能否有效提高天麻产量及质量，还有待于进一步的野外观察证明。

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