在斑马鱼仔鱼脑部异体移植胚胎细胞的尝试

曹静晖，魏雅岚，严继舟

(上海海洋大学水产与生命学院生物系，上海　201306)



在斑马鱼仔鱼脑部异体移植胚胎细胞的尝试

曹静晖，魏雅岚，严继舟

(上海海洋大学水产与生命学院生物系，上海201306)

摘要：为建立斑马鱼(Danio rerio)脑部细胞移植模型，先用红色荧光染料标记供体胚胎细胞，再移植细胞到AB品系和两种转基因斑马鱼仔鱼脑部。荧光显微镜和组织学切片观察发现移植细胞沿组织或细胞间隙而不是通过血管向周围组织扩散，但细胞增殖分化不明显。在细胞移植24 h后，脑部组织学结构与对照组无明显差别。带有白血病基因的胚胎细胞在AB仔鱼的脑部没有产生肿瘤样增生和转移。相比之下，正常胚胎细胞在白血病模型的仔鱼脑部非白血病细胞聚集区出现较多增殖和迁移。这些结果提示脑局部微环境不支持移植细胞的增殖分化；细胞移植只能弥补局部细胞的空疏而不能用作细胞替代治疗。

关键词：斑马鱼(Danio rerio);胚胎细胞;细胞移植;脑;白血病

神经退行性疾病是一类以神经元退行性病变或凋亡,从而导致脑功能和脑结构的逐步丧失，个体行为异常乃至死亡为主要特征的疾病。随着社会逐渐步入老龄化,神经退行性疾病的发病率不断攀升，目前尚无有效的治疗措施。干细胞研究的迅速发展为这类疾病的治疗提供了新的研究途径，多种干细胞治疗神经退行性疾病动物的尝试尚在进展中[1]。

干细胞是机体在发展适应过程中保留的一部分未分化的原始细胞，具有全部或部分分化能力。在一定条件下这些干细胞可以在体外持续性增殖和分化成多种功能的细胞或组织器官。临床上可以用自身或他人的干细胞和干细胞衍生物替代、修复病变的神经组织,以恢复其生理功能，即干细胞移植治疗，为传统医学方法难以医治的中枢神经系统疾病提供了十分广阔的临床治疗前景[2]。

斑马鱼(Daniorerio)和人类的基因在关键区域存在100%的同源性，大约70%的人类基因在斑马鱼体内都对应着至少一个同源基因，这使其成为研究人类疾病的重要模式生物。使用斑马鱼作为研究对象还有许多优势，诸如繁殖快，饲养成本低廉；胚胎和仔鱼半透明便于生物光信号可视化，可以在高分辨率的共聚焦显微镜下研究细胞在组织中的扩散[3]。更为重要的是斑马鱼与脊椎动物的免疫系统存在许多共同点，但更适合于异体细胞移植实验。斑马鱼的免疫系统只在受精4～6周后才能在形态和功能上发育成熟，因此异体移植实验在斑马鱼发育前期进行时，不需要免疫抑制处理[4-5]。

斑马鱼胚胎和仔鱼的异种移植模型已被广泛用于研究肿瘤的发生、发展和复发[6]。多种肿瘤细胞在移植到斑马鱼胚胎和仔鱼体内时，会增殖、形成囊块、诱导血管生成，并扩散；人类黑色素瘤细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞移植到受精后2 d斑马鱼的卵黄囊时，会增殖扩散并形成囊块，并且在囊块内部斑马鱼的血管内皮细胞会被诱导生成[7]；人类和鼠类的肿瘤细胞在移植到受精后48 h的斑马鱼的肠下静脉附近时，其所表达生血管成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子会诱导新的微脉管系统的快速形成[8]；乳腺癌细胞系移植到斑马鱼胚胎后，迁移到胚胎的尾部形成囊块[9]；人类胶质瘤细胞在移植到斑马鱼胚胎后，能增殖生成肿瘤，且这些肿瘤能诱导血管新生[10]；向发育中的斑马鱼移植具有扩散性的黑色素瘤细胞，后者会分泌一种强力的胚胎类似物，导致胚胎体轴的发育异常[11]。斑马鱼异种移植模型也被用来代替鼠类模型，快速高效得评估人类多能干细胞来源的内皮细胞的功能[12]。不同于上述的异种移植，本实验将研究斑马鱼同种异体脑部移植胚胎细胞的可行性。通过建立斑马鱼脑部异体移植胚胎细胞的模型，为人类神经退行性病变的治疗提供参考。

1材料与方法

1.1试验试剂和仪器

乙醇95%，无水乙醇，二甲苯(上海高信化玻仪器有限公司)；Dextran,Texas Red®,10,000 MW(D1864，Life Technologies，美国)；MicroInjectorTM(Tritech Research，美国)；glass capillary (WorldPrecisionInstruments，美国)；Sutter P-97 Pipette Puller(WorldPrecisionInstruments，美国)；M-152Manipulator (NARISHIGE，日本)；CellTram®Air (Eppendorf，德国)；MIC01056倒置显微镜(Carl Zeiss Jena，德国)。

史密斯固定液配制：重铬酸钾875μL、甲醛100 μL、乙酸25 μL。

1.2试验材料

本实验使用的三种不同品系的斑马鱼均来源于本实验室饲养，分别为野生型斑马鱼(AB系)，血管荧光型斑马鱼(FLK1启动子驱动的GFP转基因鱼)和MLL-AF9-GFP转基因斑马鱼(AF9)。

1.3方法

1.3.1供体细胞的准备

选取发育至1 k细胞期的胚胎细胞作为移植供体。按先前报道的方法收集鱼卵[13]，然后固定在琼脂糖凝胶槽中。待其发育至16细胞期，使用显微注射仪，将荧光染料葡聚糖德克萨斯红(可被激发出红色荧光)注射到鱼卵的卵黄囊中，用于追踪胚胎细胞系。待其发育至1 k细胞期，供细胞移植使用。

1.3.2细胞受体的准备

斑马鱼仔鱼作为细胞移植受体，即斑马鱼卵受精后发育至48 h(48 hpf)，接受细胞移植实验。

1.3.3细胞移植设备的准备

使用拉针仪将玻璃毛细管拉断为两根细胞移植用针，用镊子为针尖开口，口径应大于移植细胞的直径，将针装配到气压细胞移植设备上，并固定于显微操作设备上，调整气压，使针孔内外气压达到平衡。

1.3.4细胞移植

在体视显微镜下，将受体仔鱼固定在琼脂糖凝胶槽上，使用细胞移植设备，抽取供体鱼卵动物极中的细胞，移植到受体幼鱼的脑部，再在倒置显微镜下追踪观察斑马鱼仔鱼脑部的荧光信号[14-18](图1)。共成功进行移植实验的斑马鱼仔鱼62尾，并且存活至移植后24 h以上。

图1　细胞移植示意图

示供体细胞染色(a)、供体细胞吸取(b)和显微注射三个阶段(c)。

1.3.5斑马鱼仔鱼石蜡切片

接受移植的斑马鱼仔鱼放入1.5 mL离心管，移除多余水分，在1 mL史密斯固定液中固定12 h；实验仔鱼固定好后，移除史密斯固定液，加入0.5 mL 30%～100%乙醇梯度脱水、二甲苯透明和包埋。包埋时，使斑马鱼仔鱼侧着躺平，使用石蜡切片机从斑马鱼仔鱼的左侧到右侧连续切片切、苏木精-伊红(HE)染色和封片后对细胞移植部位进行拍照[19]。

1.3.6斑马鱼仔鱼细胞移植取样时间及样本数量的选择

根据斑马鱼饲养光照昼夜时间，我们选择在中午让斑马鱼进行交配产卵。收集供体胚胎发育至1 k细胞期进行移植试验。根据预实验结果，选择在移植后1 h取样进行荧光或连续切片观察细胞移植情况，以后每6 h继续取样观察细胞的移植情况，连续3 d。对照和不同时间段移植的斑马鱼每组观察至少有三尾活体样本，中途死亡的需要补做移植试验。

2结果

2.1脑部细胞移植的活体观察

为了活体观察脑部移植细胞与血管的关系，按图1所示在Flk1-GFP转基因斑马鱼脑部移植Texas Red标记的葡聚糖染色的胚胎细胞。在细胞移植后1 h，斑马鱼仔鱼的脑部前端可以观察到带有红色荧光信号的一团移植细胞；在细胞移植后18 h，斑马鱼仔鱼脑部前端的细胞团已扩散到斑马鱼的整个脑部，扩散细胞的位置与脑部血管分布(绿色信号)之间没有明显联系。对照组显示了血管在斑马鱼仔鱼脑部的分布情况(图2)。

图2　接受细胞移植的FLK1斑马鱼仔鱼脑部的荧光观察

2.2细胞移植的组织学观察

为了明确细胞移植后的脑部组织学变化，对上述细胞移植的斑马鱼脑组织进行组织学切片和HE染色观察。在细胞移植后1 h，与对照组相比，接受细胞移植的斑马鱼仔鱼在脑部的脑间隙和脑室中发现了移植细胞，而在对照组的脑间隙和脑室中没有发现任何细胞。移植细胞与周围正常脑细胞相比，正常脑细胞的细胞质偏噬碱性，而移植细胞的细胞质偏噬酸性。在HE染色后，正常脑部细胞偏蓝，而移植细胞偏红，且移植细胞的核质比较大。在细胞移植6 h后，移植细胞开始出现扩散现象，周围正常脑部组织中开始出现移植细胞，其仍保持细胞质偏红的特征。在细胞移植18 h后，部分接受移植的斑马鱼仔鱼的脑室中还残留着少量移植细胞，在周围正常的脑部组织中也能找到一些移植细胞，它们的特征并未发生明显改变。在细胞移植后24 h后，脑室中已找不到移植细胞，在脑室周围的组织中仍能发现部分移植细胞，这些移植细胞仍保持着原有特征，在组织结构上，接受细胞移植的斑马鱼仔鱼和对照组中的斑马鱼仔鱼已无区别(图3)值得注意的是，整张切片没有发现炎性浸润和炎症反应，说明移植细胞的减少并非免疫排斥。

2.3正常仔鱼移植AF9细胞的荧光显微镜观察结果

为了检验癌细胞移植后的浸润性，将人类白血病融合基因MLL-AF9-GFP转基因斑马鱼的胚胎细胞染色后注射到正常AB斑马鱼(图4)。在细胞移植后1 h，斑马鱼仔鱼的脑部前端可以观察到带有红色荧光信号的两团移植细胞；在细胞移植后18 h，斑马鱼仔鱼脑部前端只能观察到少量移植细胞；在细胞移植后24 h，斑马鱼仔鱼脑部前端移植细胞的信号几乎消失了。

2.4 AF9-GFP仔鱼移植正常细胞的荧光显微镜观察结果

随后又检测了正常AB鱼胚胎细胞移植到MLL-AF9转基因斑马鱼后的生长情况(图5)。对照组(0 hpt)显示了细胞移植前MLL-AF9基因在斑马鱼仔鱼脑部的表达位置。在细胞移植后1 h，斑马鱼仔鱼的脑部前端可以观察到带有红色荧光信号的一片移植细胞；在细胞移植后18 h，斑马鱼仔鱼脑部前端能观察到少量聚集的细胞；在细胞移植后24 h，聚集的细胞团变大，移植细胞出现了少许增殖现象。移植细胞与MLL-AF9细胞不在同一区域。

图4　AF9供体细胞移植到AB受体幼鱼脑部的荧光观察

hpf表示hours post fertilization，hpt表示hours post transplant，0 hpt为对照，没有移植的正常AB仔鱼。

图5　AB供体细胞移植到AF9受体仔鱼脑部的荧光观察

3讨论

本实验的目的是想利用斑马鱼为模型研究干细胞移植治疗脑神经细胞退化的可行性。为此首先检验了干细胞移植后的致癌性，其次是移植细胞增生分化和细胞替代治疗的能力。

许多报道显示人类肿瘤细胞移植入斑马鱼胚胎、仔鱼或肝脏都表现出侵润和微转移现象[20]；斑马鱼胚胎移植人类恶性胶质瘤细胞和其中的胶质瘤干细胞后，在胶质瘤干细胞的促进下，胶质瘤细胞沿斑马鱼胚胎的血管快速扩散，并表现出强烈的侵润性[21]；胶质瘤细胞可以在斑马鱼胚胎中存活、增殖并诱导血管分支的形成[22]。

MLL-AF9是一种白血病基因，MLL-AF9在人类CD34+细胞中表达会引起严重的淋巴系白血病、髓系白血病或混合型白血病。本次实验将转人类MLL-AF9-GFP基因的斑马鱼的胚胎细胞移植到正常AB品系斑马鱼仔鱼脑部，同时也将正常AB品系斑马鱼的胚胎细胞移植到MLL-AF9-GFP转基因的斑马鱼仔鱼的脑部，以此观察带有白血病基因的细胞在正常斑马鱼体内的致病性和正常的斑马鱼细胞治疗白血病基因表达细胞的可能性。细胞移植结果显示带有白血病的细胞在正常斑马鱼仔鱼的脑部没有增殖的迹象，移植细胞数量逐渐减少，无法像癌细胞一样形成囊块；相反移植到MLL-AF9-GFP转基因斑马鱼仔鱼的脑部的正常胚胎细胞表现出有限增殖。虽然移植细胞团逐渐增大，但远离转基因细胞团。这些结果不仅证实微环境对于白血病干细胞的影响较大[23]，也提示移植的胚胎细胞和转基因细胞分属两个不同微环境，而斑马鱼体内微环境更适合于正常细胞移植和生成。

MLL-AF9转基因鱼细胞移植实验说明斑马鱼有很强抗癌变和抗外源细胞整合的能力。许多报道也发现正常细胞和多种干细胞及少部分肿瘤细胞，移植到斑马鱼胚胎和仔鱼后只能增殖和扩散，无法形成囊块，也很少整合到斑马鱼组织。人类成纤维细胞移植到受精后2 d斑马鱼的卵黄囊时，会发生迁移，但不会增殖扩散并形成囊块[7]；人类脂肪干细胞在移植到斑马鱼胚胎时，不仅能够存活和增殖，而且在短时间内保持其未分化的状态[24]；人类严重髓性白血病细胞和胚细胞移植到受精后48 h的斑马鱼体内时，会停留在循环系统内数日，且不影响斑马鱼的发育[25]；人类黑色素瘤细胞在移植到斑马鱼囊胚期胚胎时，存活并扩散，但黑色素瘤细胞并没有形成肿瘤或整合入宿主器官，而是分散在细胞间隙中，倾向于分布在正常的皮肤微环境[26]；人类胚胎干细胞来源的内皮细胞异种移植到斑马鱼胚胎后，只能形成不稳定的管脉系统，不能整合入斑马鱼的血管[27]；人类纤维细胞移植入斑马鱼胚胎后，迁移并增殖，但没有整合入宿主的组织[28]。

不同于上面人类细胞的异种移植实验，我们采用的是同种异体移植，即注射斑马鱼发育至1 k细胞期的胚胎细胞到受精后48 h的斑马鱼头部。移植的胚胎细胞表现出了扩散的现象，且其扩散位置与血管分布没有明显关系；移植的胚胎细胞一直保持其原有特征，没有表现出明显的分化现象和致瘤性。移植后表现出的低增殖少分化的现象也可能预示移植的胚胎细胞中含有胚胎干细胞功能的数量太少。有研究指出在发育至4细胞期后，斑马鱼胚胎中只有部分细胞表达胚细胞信号[29]。但加大细胞移植量移植24 h后，其脑部结构形态和对照组并无区别，说明微环境不适应应该是决定因素。

总之，斑马鱼胚胎细胞注射到斑马鱼仔鱼脑部后会沿着组织间隙迁移并扩散到周围的脑部组织中。虽然不能肯定移植细胞的最终去向，但推测这些胚胎细胞可能大部分凋亡，少量整合入正常的组织。我们认为脑部细胞移植只能弥补少量的细胞空缺，并不能替代治疗已有的细胞(包括不正常细胞)。脑细胞移植的效果取决于局部微环境改善，也就是说，治疗神经退行性病变通过注射干细胞代谢物刺激神经再生应该更有前途。但斑马鱼的脑部环境毕竟与人类不同，我们的推测有待进一步的临床检验。

致谢：感谢上海海洋大学海洋生物系统和神经研究所范纯新和张慧对于本实验图片拍摄方面的指导，感谢吕恺伦和高思琪在显微注射和石蜡切片技术方面的指导。

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(责任编辑：邓薇)

收稿日期：2015-09-28；

修订日期：2016-04-07

第一作者简介：曹静晖(1992-)，理学学士，专业方向为水生生物学。E-mail:ccjjhh001@sina.com 通讯作者：严继舟。Email:jyan2@shou.edu.cn

中图分类号：S917.4

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)04-0003-06

Trials on embryo cell allotransplantations in Danio rerio larval brain

CAO Jing-hui,WEI Ya-lan,YAN Ji-zhou

(DepartmentofBiology,CollegeofFisheriesandLifeSciences,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China)

Abstract：To establish a brain cell transplant model,here Danio rerio embryo cells were labeled with red fluorescent dye and separately transplanted into the larval brains of AB line and two different transgenic D.rerio.Fluorescence microscopic and histological observations showed the transplanted cells were migrated along interstitial/intercellular space instead of blood vessels,revealing little proliferation and differentiation.24 hours after transplantation,the brain histological structure looked similar to the control.The transplanted embryo cells from the leukemia transgenic fish did not display any neoplasm proliferation and metastasis in AB larvae.In comparison,the transplant cells from AB lines showed a bit more proliferation and migration at the region far from leukemia cell aggregate in the brain of leukemia transgenic fish.These results suggested that the brain microenvironment was not suitable for the growth of the cell transplants,thereby cell transplant cannot replace the existing cells but fill a few cell sparsities.

Key words：Danio rerio;embryo cell;cell transplant;brain;leukemia

资助项目：上海海洋大学大学生创新项目(A-0218-12-0001-003)；上海海洋大学斑马鱼再生技术启动基金(A-2400-12-0007)