解脲脲原体生物群分布与耐药性差异研究

张　艳，华　川，李苏利，宋　娟，王　芊，李　扬



解脲脲原体生物群分布与耐药性差异研究

张艳，华川，李苏利，宋娟，王芊，李扬

解放军252医院，保定071000;

摘要：目的了解本地区泌尿生殖道感染人群中解脲脲原体感染的生物群分布特点及其耐药情况。方法采用液体选择培养基对泌尿道分泌物标本进行培养、鉴定及药敏；选取解脲脲原体阳性标本进行PCR分群和分型；分析各生物群型别及其耐药性差异。结果985例检测标本中，单独解脲脲原体阳性395例，总阳性率为40.10%，其中女性368例，男性27例，其阳性率分别为42.45%、22.88%，女性阳性率高于男性，其差异有显著统计学意义(χ2=16.550,P<0.01)。395例单独解脲脲原体阳性标本作PCR分群分型显示，单独生物一群阳性278例，阳性率为70.89%；单独生物二群阳性80例，阳性率为20.25%。单独生物一群中以单一血清6型(121例，43.21%)、3/14型(96例，35.53%)感染为主。单独生物二群均为混合血清型感染，基因亚型1(血清型2、5、8、9)和亚型3(血清型7、11)混合感染(49例，61.25%)；基因亚型2(血清型4、10、12、13)和亚型3(血清型7、11)混合感染共检出(31例，38.75%)。结合药敏结果发现，解脲脲原体对喹诺酮类药物耐药率较高，对四环素类药物较敏感，且多重耐药现象严重。生物一群对司帕沙星的耐药性高于生物二群，二者差异有统计学意义(χ2=5.701，P=0.017<0.05)，且生物一群对米诺环素、多西环素、阿奇霉素的耐药性远高于生物二群，其差异有显著统计学意义(χ2=10.811,χ2=19.103,χ2=7.541，P均<0.01)。进一步结合分型结果发现，生物一群中单一血清型S6耐药率最高的抗菌药为氧氟沙星(76.86%)，S1型耐药率最高的抗菌药为罗红霉素(95.74%)，S3/14型耐药率最高的抗菌药为罗红霉素和阿奇霉素(均为86.46%)。结论泌尿生殖道感染人群中解脲脲原体阳性率较高，女性高于男性，以生物一群单一血清型感染为主；本地区耐药形势严峻，生物一群耐药性高于生物二群；生物一群中各血清型的耐药性存在不同程度的差异。结合解脲脲原体生物分群分型结果可辅助合理选用抗菌药物，以避免滥用致耐药株产生。

关键词：解脲脲原体；生物群；血清型；耐药性

解脲脲原体是一种介于病毒与细菌之间、能够独立存在的微生物。近年来其感染发生率呈逐年上升趋势，成为引起泌尿生殖道感染的重要病原体。目前已知解脲脲原体包括两个生物群[1]，14个血清型：生物一群即微小解脲脲原体(Ureaplasmparvum,Up)，生物二群即解脲解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,解脲脲原体)。其中血清型1、3、6、14属于Up，2、4、5、7～13属于解脲脲原体。目前国内已有大量文献对泌尿生殖道感染患者中解脲脲原体的培养及药敏状况进行报道，但对解脲脲原体血清型及其耐药性的研究较少。因此本文就解脲脲原体的型别分布及其耐药情况进行研究，旨在为解脲脲原体耐药性在血清型水平的研究提供一定依据。

1材料与方法

1.1标本来源收集2012年11月至2013年11月我院妇科、皮肤科及泌尿外科门诊疑似支原体感染患者的泌尿道分泌物标本985例，其中男性118例，女性867例，患者年龄在20～55岁之间。所有患者均为疑似泌尿生殖道感染，且在采集标本前未用过抗生素或停用抗生素1周以上。

1.2标本采集男性用无菌男性拭子插入尿道2～4 cm处取尿道分泌物；女性用无菌女性拭子在宫颈管内1～2 cm处，取宫颈分泌物，取好的标本无菌密封送检。

1.3标本检测

1.3.1培养检测1.2支原体培养、鉴定及药敏试验采用珠海丽珠试剂有限公司支原体培养、鉴定、药敏一体化试剂盒,对分泌物标本进行支原体培养鉴定及药敏。药敏试验包括：四环素类(多西环素、米诺环素)；大环内酯类(交沙霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素)；喹诺酮类(氧氟沙星、左氧氟沙星霉素、司帕沙星)9种抗生素。严格按说明书进行操作。

1.3.2解脲脲原体阳性标本PCR检测—引物合成样本模板的制备采用煮沸裂解法。PCR引物参照叶向群等设计合成(见表1)。

表1　引物合成序列

1.3.3解脲脲原体阳性标本PCR检测—PCR扩增及电泳检测PCR反应体系(25 μL)：模板2 μL，F引物1.5 μL，R引物 1.5 μL，PCR反应液Mix12.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，凝胶成像。

上表中，1S1、1S3、1S6、1S14分别代表生物一群血清型1、3、6、14，因血清型3和血清型14的MB基因仅有3个碱基的差异，用PCR无法区分，故归为1个基因型。2S1、2S2、2S3分别代表生物二群基因型亚型1、2、3，亚型1包含血清型2、5、8、9，亚型2包含血清型4、10、12、13，亚型3包含血清型7、11(Kong FR，1999) 。

1.4统计分析数据采用SPSS17.0进行统计分析,率的比较采用卡方检验，α=0.05为检验水准。

2结果

2.1分离培养结果经丽珠支原体培养试剂盒检测发现，985例检测标本中，解脲脲原体阳性395例，总阳性率为40.10%，其中女性368例，男性27例，其阳性率分别为42.45%、22.88%， 女性阳性率高于男性，其差异有统计学意义(χ2=16.550,P<0.01)。

2.2解脲脲原体分群及耐药结果

2.2.1生物分群395例解脲脲原体阳性标本作PCR检测，其中单纯生物一群阳性278例，单纯生物二群阳性80例，生物一群和生物二群均阳性35例，其阳性率分别为70.38%、20.25%、8.86%。另有2例女性标本PCR扩增阴性。(见图1、2)

M: 2 000 bp marker, positive results are shown in lane 1, 2, 3.

2.2.2不同生物群耐药情况由表2可见，生物一群耐药率较高的抗菌药分别为：阿奇霉素(75.54%)、罗红霉素(60.43%)、司帕沙星(60.43%)、氧氟沙星(60.00%)；生物二群耐药率较高的抗菌药分别为：司帕沙星(75.00%)、阿奇霉素(62.50%)、氧氟沙星(62.50%)、罗红霉素(62.50%)。经SPSS统计分析，生物一群对司帕沙星的耐药性高于生物二群，二者差异有统计学意义(χ2=5.701，P=0.017<0.05)，且生物一群对米诺环素、多西环素、阿奇霉素的耐药性远高于生物二群，其差异有显著统计学意义(χ2=10.811，P=0.001<0.01；χ2=19.103，P=0.000<0.01；χ2=7.541，P=0.006<0.01)。两大生物群对其余药物的耐药性差异无统计学意义(P均>0.05)。因生物一群和生物二群共同感染病例较少，故暂未对其分析。

M: 2 000 bp marker, positive results are shown in lane1, 2, 3.

表2　两大生物群耐药情况比较

Note: *represents there is difference(P<0.05), ** represents there is significant difference(P<0.01)

2.3解脲脲原体分型及耐药结果

2.3.1生物一群分型278例单独生物一群阳性标本中，单一血清型共检出264例(94.96%)，其中血清型6为121例(43.53%)，血清型3/14为96例(35.53%),血清型1为47例(16.91%)。混合血清型共检出14例(5.04%)。

生物二群分型：80例单独生物二群阳性标本中，基因亚型1(血清型2、5、8、9)和亚型3(血清型7、11)混合感染检出49例(61.25%)。基因亚型2(血清型4、10、12、13)亚型3(血清型7、11)混合感染检出31例(38.75%)。

生物一群和生物二群混合感染其检出35例，其中生物一群血清型3与2群基因亚型1(血清型2、5、8、9)混合感染21例(60%)，生物一群血清型6与2群基因亚型2(血清型4、10、12、13)混合感染14例(40%)。(见表3)

表3　PCR阳性病例感染模式

2.3.2单一血清型耐药结果由表4知，S6型耐药率最高的抗菌药为氧氟沙星(76.86%)，S1型耐药率最高的抗菌药为罗红霉素(95.74%)，S3/14耐药率最高的抗菌药为罗红霉素和阿奇霉素(均为86.46%)。3种血清型中耐药率最低的抗菌药均为米诺环素。生物一群中3种单一血清型S6、S1、S3/14对9种药物的耐药性各不相同，除司帕沙星、左旋氧氟沙星外，它们之间差异均有统计学意义(P<0.01)(见表4)。

进一步将耐药性差异有显著统计学意义的血清型间进行两两比对后发现，血清型S1与S3/14对氧氟沙星的耐药性差异无统计学意义(χ2=1.703，P=0.192>0.05), 血清型S6与S3/14对氧氟沙星的耐药性差异有统计学意义(χ2=5.308，P=0.021<0.05),其余血清型两两之间对各类抗菌药物耐药性的差异均有显著统计学意义(P均<0.01)。因生物二群均为混合感染，故暂未对其血清型进行分析。

表4　生物一群各血清型耐药情况

Note: *represents there is significant difference among S6, S1 and S3/14(P<0.01).

3讨论

我们采用液体培养法检测泌尿生殖道感染患者解脲脲原体，发现总阳性感染率为40.10%，且女性患者感染率(42.45%)大于男性患者(22.88%)，其差异有统计学意义(χ2=16.550,P<0.01)，这与文献报道一致[2-5]。目前人们比较认可的原因可能与男女生理结构特点相关，女性生殖道较短可能更易感染。女性感染患者常因感染初期症状不明显而容易忽视检查治疗，导致病情迁延和交叉感染。此外，女性患者解脲脲原体感染率会随着年龄的变化而变化，我们发现女性感染者以20～45岁居多。有研究显示[6]，30岁左右的育龄期女性感染率最高，而大于50岁的绝经后妇女解脲脲原体感染率则明显下降，这可能与不同年龄段女性的雌激素水平及性生活频率有关。有人认为解脲脲原体降解产物可能会改变女性生殖道的pH值，有利于其他细菌的感染和繁殖，从而加重感染。

本研究中，将395例解脲脲原体阳性标本进行PCR分型检测，结果显示单独生物一群感染率70.38%，单独生物二群感染率20.25%，两生物群混合感染率为8.86%。可见本地区解脲脲原体感染以单独生物一群感染为主，这与叶向群等[7]报道的粤东地区、单平囡等[8]报道的绍兴地区的生物群优势分布一致。生物一群感染中以单一血清型(94.96%)感染为主，明显高于混合血清型(5.04%)。单一血清型感染中又以6型感染率为最高(43.21%)，其次为3/14、1型感染。生物二群感染均为混合血清型感染模式，以血清型2、5、8、9和7、11混合感染为最高(61.25%)。叶南圆等[9]通过对国内解脲脲原体分型相关文献进行聚类分析发现南京以生物一群中血清型1、生物二群中血清型4居多；北京以生物二群中血清型4型为主，而长春以生物二群中血清型8型报道最多。这说明不同地区解脲脲原体型别分布有其各自的特征。关于各个型别与致病性的具体关系，各地学者的研究情况不尽相同，目前仍无统一定论。国内有学者[10]认为生物一群可导致女性生殖道炎症、不孕、胎膜早破、早产等，引起男性不育和前列腺炎等疾病。其木格等[11]研究发现在非衣原体非淋球菌感的染黏液脓性宫颈炎患者中生物二群的阳性率显著高于健康体检者。刘岩丽等[12]对输卵管妊娠患者宫颈分泌物中的解脲原体进行分群检测，发现患者组生物二群的感染率明显高于正常对照组，生物二群的感染可能与输卵管妊娠的发生有关。Kong F等[13]认为生物一群为泌尿生殖道的正常菌群，而生物二群与致病性有关。叶南圆等[9]发现血清1、3、4型的致病力明显强于其它几型。而黄珺等[6]研究认为解脲脲原体血清型3可增加宿主发病的可能性，血清型6与女性泌尿生殖道感染无关。De Francesco等[14]也研究认为血清型6主要有存在于阴道菌群正常的无症状女性中。

本研究中药敏结果显示，解脲脲原体对氧氟沙星(53.13%)、罗红霉素(51.72%)、司帕沙星(41.25%)、氧氟沙星(42.50%)耐药率较高，提示临床不应再经验性应用这些药物，以免加剧其耐药形势。对米诺环素(93.33%)、多西环素(93.13%)敏感率较高，也提示临床在无用药禁忌的情况下，可首选这两种药物进行治疗。

结合我们的生物分群结果得知，生物一群和生物二群耐药率较高的抗菌药种类是一致的，包括阿奇霉素、罗红霉素、司帕沙星、氧氟沙星。然而生物一群对司帕沙星的耐药性高于生物二群，二者差异有统计学意义(P<0.05)，且生物一群对米诺环素、多西环素、阿奇霉素的耐药性远高于生物二群，其差异有统计学意义(P均<0.01)。这与葛锁华等[15]报道的生物二群耐药较为严重的结论有所不同。而丁进亚等[16]研究认为两大生物群间的耐药性差异无统计学意义,生物种群与临床用药关系不大。这种研究差异可能与样本构成、样本量大小及地域性等因素有关。对于本研究人群中出现的两大生物群混合感染的情况，因例数有限未对其耐药性进行分析，不过有报道认为[17]不同型别的混合感染可导致基因重组或基因突变，从而引起耐药株形成。

进一步结合分型结果得知，不同血清型的耐药性存在不同程度的差异。生物一群中血清型S6耐药率最高的抗菌药为氧氟沙星(76.86%)，S1型耐药率最高的抗菌药为罗红霉素(95.74%)，S3/14耐药率最高的抗菌药为罗红霉素和阿奇霉素(均为86.46%)。3种血清型中耐药率最低的抗菌药均为米诺环素，这也提示我们临床在无用药禁忌时可考虑将米诺环素作为一线用药。经统计分析，除血清型S1与S3/14对氧氟沙星的耐药性差异无统计学意义(P>0.05)外,血清型S6(76.86%)对氧氟沙星的耐药性高于S3/14(62.50%)，其差异有统计学意义(P<0.05),其余血清型两两之间对试验所用9种抗菌药物耐药性的差异均有显著统计学意义(P均<0.01)。国内有学者[18]曾研究发现血清型1对多西环素、氧氟沙星和四环素的耐药率差异有显著性。

综上，我们对解脲脲原体生物分群分型与耐药性的关系进行了初步研究，在一定程度上为临床合理用药提供依据。也建议临床有必要进行解脲脲原体的生物分群分型检测，以参照结果合理选用抗菌药物进行治疗，尽可能避免耐药株的产生。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.010

中图分类号：R37

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)01-0045-06

收稿日期：2015-04-22；修回日期:2015-08-23

Ureaplasma urealyticum serotypes distribution and drug resistance

ZHANG Yan,HUA Chuan,LI Su-li,SONG Juan,WANG Qian,LI Yang

(TheNo.251hospitalofPLA,Baoding071000,China)

Abstract:We investigated the Ureaplasma urealyticum infection and the distribution of its serotypes and genotypes types in patients with urogenital infections in Baoding area. Samples were firstly screened with mycoplasma culture and identification kit, and then the positive cultural samples were subtyped by PCR method. The positive rate of U. urealyticum was 40.10%(395/985). The 395 positive cultural samples were subtyped with PCR, and the positive rate of biovar1 was 70.89% and the positive rate of biovar2 was 20.25%. The serotypes of 278 biovar1 positive samples were identified with PCR; there were 121 samples with serovar 6(43.21%). The serotypes of 80 biovar2 positive samples were genotyped, and the results showed that the rate of mixed genotype 1 and 3 was higher than the others. The biovar1 of U. urealyticum were predominated in patients with urogenital infections in Baoding area. And U. urealyticum serovar 6 and serovar 3/14 were common serotypes. It is significant to investigate the distribution of different serotypes of Ureaplasma in different areas.

Keywords:Ureaplasma urealyticum; biovar; serotype; drug resistance

Email:breeze0827@sina.com