HPLC法测定黑豆皮中原儿茶酸、表儿茶素的含量

刘子明，李国华

（吉林工程职业学院，吉林四平136001）



HPLC法测定黑豆皮中原儿茶酸、表儿茶素的含量

刘子明，李国华*

（吉林工程职业学院，吉林四平136001）

摘要：建立HPLC波长切换法同时测定黑豆皮中原儿茶酸、表儿茶素含量的方法。固定相为shim-pack VP-ODS C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液，流速为1.0 mL/min，检测波长为260、280 nm，柱温35℃。原儿茶酸、表儿茶素分别在0.010 52 mg/mL～1.052 mg/mL（r=0.999 6）和0.012 24 mg/mL～1.224 mg/mL（r=0.998 9）浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为99.46%（RSD=1.08%，n=6）和99.06%（RSD=1.02%，n=6）。

关键词：黑豆皮；原儿茶酸；表儿茶素；高效液相色谱法；波长切换法；含量测定

黑豆种皮来源于豆科植物黑豆Glycine max（L.）Merr.的干燥成熟种皮，又称料豆衣、乌衣等。中国自古就有“大豆数种，唯黑入药”的记载。黑豆皮具有解毒利尿，明目益精，养血疏风之功效。可治疗阴虚烦热，盗汗，眩晕，头痛，风痹等症［1］。现代研究表明，黑豆皮提取物还具有明显的抗氧化、抗炎、抑制诱变、抗心血管疾病等作用［2-5］。近年，对黑豆皮化学成分的研究虽有一些文献报道［6］，但对其含量测定方面的研究报道较少。本研究主要是以其成分原儿茶酸和表儿茶素为研究对象，采用HPLC波长切换法对其进行含量测定，并对其进行方法学验证。

1　仪器与试剂

1.1仪器

SHIMADZU 2010AHT高效液相色谱仪：日本岛津。

1.2试剂

原儿茶酸对照品（批号：110809-200604）、表儿茶素对照品（批号：110878-200102）：中国食品药品检定研究院；黑豆皮：市购；甲醇为色谱纯、磷酸为分析纯、乙腈为色谱纯：天津福晨化学试剂厂；娃哈哈纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司。

2　方法与结果

2.1对照品溶液的制备

分别精密称取干燥至恒重的原儿茶酸、表儿茶素对照品适量，75%甲醇溶解并定容，分别配成各含0.1 g/L的对照品储备液。再分别精密量取适量各对照品储备液，分别置于10 mL容量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度，即得对照品溶液，备用。

2.2供试品溶液的制备［7-8］

称取黑豆皮适量，粉碎，称取其细粉（过5号筛）5g，精密称定，置250 mL具塞三角瓶中，精密加入75%甲醇100 mL，超声（250 W，50 kHz）处理35 min，放冷，用75%甲醇补足损失的重量，摇匀，过滤，收集滤液，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3色谱条件与系统适应性试验［9］

色谱柱：shim-pack VP-ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，批号：3082427）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液；进样量：10 μL；流速1.0 mL/min；检测器：二极管阵列检测器。各主成分与相邻峰之间的分离度大于1.5，分离度良好，色谱条件见表1。

步骤2：按照式(12)～(14)处理流程，对不连续的虚拟阵列流型进行内插重构，得到连续虚拟阵列流型响应；

表1　色谱条件Table 1　Chromatographic condition

分别取对照品、供试品注入高效液相色谱仪中进行测定，结果见图1。

2.4线性关系考察

精密称取原儿茶酸10.52 mg、表儿茶素12.24 mg、分别置于10 mL量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取0.1、0.5、1、2、5、10 mL置10 mL容量瓶中，用75%甲醇稀释至刻度。注入液相色谱仪分析，以峰面积对浓度做线性回归方程，得各成分回归方程，结果见表2。

图1　 高效液相色谱图Fig.1　The figure of high performance liquid chromatography

表2　回归方程、相关系数和线性范围表（n=6）Table 2　The table of regression equation、related coefficient and linearity range（n=6）

2.5精密度试验

精密吸取上述对照品溶液10 μL，按上述色谱条件，重复进样6次，计算得原儿茶酸、表儿茶素峰面积积分值的RSD分别为1.12%、0.89%，表明仪器精密度良好。

2.6重复性试验

取同一批样品按照2.2项下供试品溶液的制备方法制备6份，各取10 μL进样测定，结果原儿茶酸、表儿茶素含量的RSD分别为1.09%、0.91%，表明重复性良好。

2.7稳定性试验

取按2.2项下供试品溶液制备方法制备的同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、16、24 h进样10 μL，测定原儿茶酸、表儿茶素峰面积积分值的RSD为0.87%、1.03%，结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.8加样回收率试验

精密取已知含量的同一批样品适量，共6份，分别精密加入原儿茶酸、表儿茶素对照品适量，按照2.2项下制备，依法测定，计算回收率，结果见表3，表3结果表明，本法准确可靠。

2.9样品测定

取黑豆皮样品3份，每份做3个平行，按2.2项下供试品溶液制备方法制备，依法测定，计算含量，结果见表4。

表3　加样回收率测定结果（n=6）Table 3　The result of recovery rate test（n=6）

表4　样品测定结果（n=3）Table 4　The result of sample test（n=3）

3　结论

本研究以75%甲醇作为提取溶剂对样品进行超声处理，以shim-packVP-ODSC18（250mm×4.6mm，5μm）为色谱柱，检测波长为260、280nm，流速为1.0mL/min进行进样测定。并以乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，结果，原儿茶酸、表儿茶素分别在0.010 52 mg/mL～ 1.052mg/mL（r=0.9996）和0.01224 mg/mL～1.224 mg/mL （r=0.998 9）浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系，平均回收率分别为99.46%（RSD=1.08%，n=6）和99.06%（RSD=1.02%，n=6）。结果表明，采用HPLC波长切换法同时测定黑豆皮中原儿茶酸、表儿茶素的含量，该方法快速、简便、准确可靠、灵敏度高，可作为黑豆皮中原儿茶酸、表儿茶素的含量测定方法。

参考文献：

［1］黄昉，李汴生，徐志宏，等.黑豆种皮色素的测定和提取［J］.食品工业科技，2004，25（4）：112-114

［2］刘岱琳，董晋泉，王媚，等.YWD-01大孔吸附树脂分离纯化黑豆红色素的研究［J］.食品科学，2007，28（3）：85-88

［3］刘岱琳，谢文利，朱珊，等.黑豆皮花青素在制备防治糖尿病及血管并发症药物或食物的应用：中国，200810053954.3［P］.2008-10-05

［4］Astadi I R，Astuti M，Santoso U，et al.In vitro antioxidant activity of anthocyanins of black soybean seed coat in human low density lipoprotein（LDL）［J］.Food Chem，2009（112）：659-663

［5］张瑞芬，黄昉，徐志宏，等.黑豆皮提取物抗氧化和延缓衰老作用研究［J］.营养学报，2007，29（2）：160-162

［6］张翠，刘占云，於洪建，等.黑豆种皮的酚酸类成分研究［J］.中草药，2013（24）：3440-3443

［7］侯颖.HPLC法测定蠲痹抗生丸中儿茶素、表儿茶素、松果菊苷和毛蕊花糖苷［J］.中成药，2013（12）：2649-2653

［8］李晓倩，王冬梅，金秀杰，等.RP-HPLC波长切换法同时测定治偏痛颗粒中原儿茶酸等5种成分的含量［J］.沈阳药科大学学报，2015（1）：26-30

［9］刘占云，刘岱琳，白淑芳，等.HPLC法测定不同产地黑豆皮中表儿茶素的含量［J］.食品研究与开发，2011（10）：112-115

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.035

作者简介：刘子明（1979—），男（汉），讲师，主要从事食品药品分析及质量控制研究。

*通信作者：李国华，副教授，主要从事生物技术的研究。

收稿日期：2015-06-03

Determination of Protocatechuic Acid and Epicatechin in Black Soybean Coat by HPLC

LIU Zi-ming，LI Guo-hua*

（Jilin Engineering Vocational College，Siping 136001，Jilin，China）

Abstract：To establish an HPLC method of switching-wavelength simultaneous determination of the content for protocatechuic acid and epicatechin in Black soybean coat.The solid phase was shim-pack VP-DOS C18（250 mm 4.6 mm，5 μm）.The mobile phase was composed of acetonitrile-0.1%Phosphoric acid，The flow rate was1.0 mL/min.The detection wavelength was260 nm and 280 nm，and the temperature of column was 35℃. Good linear relationships were found within the range of 0.010 52 mg/mL-1.052 mg/mL（r=0.999 6）for protocatechuic acid and 0.012 24 mg/mL-1.224 mg/mL（r=0.998 9）for epicatechin.The average recovery was 99.46%（RSD=1.08%，n=6）and 99.06%（RSD=1.02%，n=6）.

Key words：black soybean coat；protocatechuic acid；epicatechin；HPLC；switching-wavelength；content determination