维生素A缺乏对缺铁性贫血的影响——体内外实验对比研究

蓝　岚，梁克纪，张羽飞，李厚忠

(1 黑龙江省牡丹江市卫生局卫生监督所传染病监督科，黑龙江牡丹江　1570001；2牡丹江第一人民医院血液科，黑龙江牡丹江　157011；3 牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江牡丹江　157011；4牡丹江医学院药学院药理研究室，黑龙江牡丹江　157011)



维生素A缺乏对缺铁性贫血的影响
——体内外实验对比研究

蓝岚1，梁克纪2，张羽飞3，李厚忠4

(1黑龙江省牡丹江市卫生局卫生监督所传染病监督科，黑龙江牡丹江1570001；2牡丹江第一人民医院血液科，黑龙江牡丹江157011；3牡丹江医学院医药研究中心，黑龙江牡丹江157011；4牡丹江医学院药学院药理研究室，黑龙江牡丹江157011)

摘要：目的：研究维生素A缺乏对缺铁性贫血的影响。方法：体内实验将SD大鼠按体重随机分为4组，分别为Fe+维生素A-Ⅰ组、Fe+维生素A-Ⅱ组、Fe+维生素A-Ⅲ组、Fe-维生素A-Ⅳ组。实验动物喂饲8w后处死后取肝脏。体外实验将大鼠原代肝细胞按Seglen法分离后，随机分为严重缺乏组A、边缘性缺乏组B、正常生理组C、治疗剂量组D，分别给予0、0.5、1.0、50μmol/L 的全反式视黄酸培养72h。用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR法)检测肝脏的转铁蛋白受体(TFR)mRNA、铁蛋白(Fn)mRNA的表达。结果：体内外实验大鼠维生素A缺乏时，肝脏TFR mRNA表达增强，而Fn mRNA表达下降，差异具有统计学意义 (P<0.05)。结论：维生素A缺乏可以使大鼠肝脏 TFR mRNA表达增强而Fn mRNA表达下降，而补充维生素A后铁缺乏造成的很多不利影响都显著减轻了。

关键词：维生素A缺乏；缺铁性贫血；转铁蛋白受体；铁蛋白

大量流行病学观察研究和临床干预研究均证实了缺铁性贫血与维生素A缺乏有关，补充维生素A有助于改善贫血，但对两者的关系的作用原理还研究得很少且维生素A对铁代谢的机制和基础还没有具体阐明[1]。转铁调节蛋白受体与铁蛋白作为细胞铁代谢的主要调节物，在调节铁的内环境稳态上起到非常重要的作用，这种调控作用近年来受到国内外学者的广泛关注[2]。本实验通过大鼠体内实验和体外原代肝细胞的培养来研究维生素A作为一种营养辅助因子，如何能够调节肝转铁蛋白受体和铁蛋白mRNA表达，进而影响铁代谢，为维生素A缺乏导致贫血提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

Ⅳ型胶原酶、Ⅰ型胶原、DMEM培养基，Gibco BRL，USA；PCR试剂TaKaRa Taq DNA Polymerase Kit，大连宝生物工程有限公司；引物，上海英骏生物技术有限公司提供合成等。

1.2大鼠体内实验

SD雄性21d龄的大鼠，52只，在饲养室适应喂养1w后，按体重随机分为4组，每组13只。Ⅰ组 Fe：35mg/kg 饲料、维生素A ：1 200μg/kg饲料；Ⅱ组 Fe：35mg/kg饲料、维生素A：0 μg/kg饲料；Ⅲ组 Fe ：35mg/kg饲料、维生素A ：120μg/kg饲料；Ⅳ组 Fe ：15mg/kg饲料、维生素A ：120μg/kg饲料。单笼常规喂养8w处死动物，分离肝脏备检[3]。

1.3大鼠体外实验

参照Seglent法[4]分离原代肝细胞，接种于Ⅰ型胶原凝胶包被的培养板内，经过12h培养后，随机分为A组(维生素A完全缺乏组)：培养液中只含有0.5%DMSO；B组(维生素A边缘缺乏组)：0.5μmol/L atRA；C组(维生素A正常对照组)：1μmol/L atRA；D组(维生素A治疗组)：培养液中含有0.5%DMSO、50μmol/L atRA。培养72h后收集肝细胞备检。

1.4引物

内参照(β-actin)、转铁蛋白受体(TfR)、铁蛋白(Fn)基因引物核酸序列为β-actin：GTGATGGTGGGAATGGGTCAG(上游5’→3’)、TTTGATGTCACGCACGATTTCC(下游5’→3’)；TfR：ACATGGACAGGAATACGTTC(上游5’→3’)、CAATCGGATGCTTTACGTCC(下游5’→3’)；Fn：GTCTCCCTCGCAAGTGCGCC(上游)、下游：TGCATTCAGCCCGCTCTCCC(5’→3’)。分子量分别为512、708、250。扩增反应在PCR-100CRTMPCR仪上进行，PCR条件为94 ℃预变性4min，94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸50 s，各指标经过35个循环。保持72℃10min，给予4℃储存[5]。2%琼脂糖凝胶电泳处理PCR产物，在凝胶图象分析系统上扫描电泳结果，比较TFR、Fn产物的密度值，与β-actin的比。

1.5数据处理

2结果与分析

图1—4中Ⅱ组、Ⅲ组和Ⅳ组结果显示，TFR mRNA表达增强，Ⅰ组TFR mRNA的表达最低，Fn mRNA的表达趋势与之相反(P<0.05)；体外实验随着atRA剂量的增加、TFR mRNA表达下调，Fn mRNA表达上调(P<0.05)。可见，在肝细胞维生素A缺乏时，TFR mRNA在肝脏表达增加，而Fn mRNA表达降低，提示，在维生素A缺乏时机体通过影响大鼠铁代谢，肝细胞从血中摄取铁增加，从而红细胞因铁的利用降低而导致贫血的发生。补充atRA可缓解这种改变，TFR mRNA在肝脏的表达减少，Fn mRNA的表达增加，使贫血得到缓解。

图1　体内实验大鼠肝脏转铁蛋白受体TFR mRNA的表达(708bp)

图2　体外实验大鼠atRA作用后各组TFR mRNA的表达(708bp)

图3　体内实验大鼠肝脏铁蛋白mRNA的表达(250bp)

图4　体外实验atRA作用后各组Fn mRNA的表达(250bp)

3讨论

大量流行病学观察研究和临床干预研究均证实了贫血与维生素A缺乏有关，维生素A缺乏影响贫血症状的核心机制可能通过调节铁代谢，研究维生素A对铁代谢影响及相关机制，不仅可以为维生素A缺乏如何导致贫血提供理论依据，对于制定合理的营养干预方案、预防和治疗维生素A和铁这2种营养素缺乏症具有重要的指导意义。对机体铁代谢相关基因的发现，为从微观水平研究维生素A对铁代谢基因的影响提供了基础。细胞铁的稳态主要被几种蛋白所调控，这些蛋白包括完成细胞摄取功能的转铁蛋白受体、完成贮存功能的铁蛋白和调节细胞铁浓度的中心蛋白—铁调节蛋白(IRP)，其数量直接关系到细胞铁代谢的平衡，它们协作完成铁在细胞内的利用，确保在细胞需要时有足够的铁供给，但却避免铁毒性[6]。

本次体内外实验对比结果一致，表明大鼠维生素A缺乏时，肝脏铁蛋白降低、转铁蛋白受体升高，这种作用直接导致肝细胞对铁的供给、需求增加，当机体内维生素A缺乏时铁在各脏器中的分布发生改变，使机体在肝脏中铁的含量增加，从而红细胞中含量降低，使贫血更加严重。本实验在补充atRA后，这种贫血的恶性症状得以缓解、减轻，结果提示，维生素A缺乏时可通过减少铁蛋白、增加转铁蛋白受体基因的表达来调控铁代谢，当体内维生素A缺乏时，会出现机体铁分布异常，从而导致铁利用障碍，这与Annet[7]的研究观点相同。但维生素A缺乏是否影响铁结合蛋白的结合活性，进而影响转铁蛋白受体(TfR)—铁蛋白(Fn)的表达还需要进一步研究。◇

参考文献

[1]徐筠，伊冰.维生素A缺乏与贫血[J].国外医学(卫生学分册)，2003，30(5)：287-291.

[2]蓝岚，王朝旭，史锐，等.全反式视黄酸对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响[J].卫生研究，2009，38(5)：603-606.

[3]徐小磊，王朝旭，苏畅，等.维生素A缺乏对大鼠铁代谢影响[J].中国公共卫生，2008，24(10)：1225-1226.

[4]王莹，张先杰，宋茂民，等.三明治构型大鼠原代肝细胞长期培养及生物学特性的研究[J].首都医科大学学报，2007，28(1)：2017-2031.

[5]Ronit Erlitzki，Multiple.Conserved Iron-responsive Elements in the 3’-Untranslated Region of Transferrin Receptor mRNA Enhance Binding of Iron Regulatory Protein 2[J].J Biol Chem，2002，(277)45：42579-42587.

[6]RD Semba1，MW Bloem .The anemia of vitamin A deficiency：epidemiology and pathogenesis[J].European Journal of Clinical Nutrition，2002，56：271-281.

[7]Annet J.C.Roodenburg C，Live E，et al.Supplemental vitamin A enhance the recovery from iron deficiency in rats with chronic vitamin A deficiency[J].British Journal of Nutrition，1996，75：623-636.

(责任编辑李婷婷)

基金项目：国家自然科学基金(项目编号：30872107)；黑龙江省自然科学基金(项目编号：D200641)。

作者简介:蓝岚(1981—)，女，硕士，主治医师，研究方向：传染病防控。

Effects of VA Deficiency on Iron Deficiency Anemia in Vivo and in Vitro Experiments

LAN Lan1，LIANG ke-ji2，ZHANG Yu-fei3，LI Hou-zhong4

(1Health Supervision Institute of Mudanjiang Municipal Health Bureau，Mudangjiang 157000，China；2The First Hospitl of Mudanjing，Mudanjiang 157011，China；3Medical Research Center，Mudanjing Medical University，Mudanjian 157011，China；4Department of Pamacy，Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China)

Abstract：ObjectiveTo study the effects of vitamin A (VA)deficiency on iron deficiency anemia in vivo and in vitro experiments in rats.MethodVivo study：Totally 52 male SD rats were divided randomly into 4 groups according to their body weights and every group including normal VA group(Ⅰ)，entire VA deficient group(Ⅱ)，slight VA deficient group(Ⅲ)，slight VA and iron deficient group(Ⅳ).After they were raised for 8 weeks，the rats were sacrificed.Vitro sturdy：Rat primary hepatocytes were isolated by two - step in situ collagenase perfusion method by Seglent，and treated with 0，0.5，1，and 50μmol/L atRA respectively for 72h.The level of liver and hepatic transferring receptor mRNA and ferritin mRNA expression were measured using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)method.ResultRat liver TFR mRNA levels were increased by VA deficiency，Fn mRNA expression was decreased(P<0.05).ConclusionVA deficiency could change hepatic expression of TFR mRNA and Fn mRNA.AtRA supplementation inhibited these expressions，which in turn led to anemia.

Keywords：vitamin A deficiency；iron deficiency anemia；transferrin receptor；ferritin