一株抗真菌毛霉的分离鉴定及其抗菌活性检测

程群仙,孙褔琴 ， 吴方方， 张　玉， 王　雅， 杨　成

(皖南医学院　1.临床医学院；2.微生物学与免疫学教研室，安徽　芜湖　241002)



一株抗真菌毛霉的分离鉴定及其抗菌活性检测

程群仙1,孙褔琴1， 吴方方1， 张玉1， 王雅1， 杨成2

(皖南医学院1.临床医学院；2.微生物学与免疫学教研室，安徽芜湖241002)

【摘要】目的：分离和识别一株抗真菌毛霉菌,并测试其抗菌活性。方法：采用稀释平板涂布法分离土壤中真菌；以杯碟法初步测定发酵液抗真菌活性；通过菌落及孢子进行形态学鉴定；以薄层色谱-生物自显影技术分离检测抗菌活性成分。结果：从土壤中分离出一株对白色念珠菌具有较强抑制活性的菌株F1，抑菌圈直径为20.5 mm，形态学初步鉴定为毛霉；该毛霉发酵液乙酸乙酯相在甲醇∶三氯甲烷(1∶4)展开系统，结果显示有两个组分对白色念珠菌具有抑制活性，其Rf值分别为0.15和0.6。结论：来自土壤的毛霉发酵液乙酸乙酯相具有抑制白色念珠菌的活性组分。

【关键词】毛霉；薄层层析；生物自显影；抗菌成分检测

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2016.03.028

近年来，随着抗生素、皮质类固醇激素、免疫抑制剂及抗肿瘤药物的广泛使用，器官移植、介入性治疗手段的开展，恶性肿瘤、艾滋病、糖尿病及人口老年化等原因，念珠菌等深部真菌感染发病率呈迅速上升趋势，并成为导致这类患者死亡的主要原因之一[1]。随着大量广谱性抗真菌药物的应用，临床上又出现大量抗药性的念珠菌等耐药菌株，因此，寻找新型有效的抗真菌药物成为研究热点[2]。另一方面，由于微生物种类及代谢产物种类多，繁殖迅速等特点，一直被认为是发现新型抗菌药物的重要途径之一[3]。然而，要从众多的微生物次生代谢产物中筛选、分离和提取有效的抗菌成分，建立灵敏、方便、快捷的活性检测方法就显得尤为重要。为此，本实验采用稀释平板涂布法分离来自土壤的腐生真菌，利用杯碟法对分离出的真菌菌株进行抗菌活性初筛，结合薄层层析-生物自显影 (TLC-Bioautography)技术[4-5]，对其活性成分进行分离并测定，为后期分离纯化该活性成分提供实验依据。

1材料与方法

1.1仪器与试剂MJ-160B型霉菌培养箱(上海跃进医疗器械厂)；GWP-P80A型隔水式恒温培养箱(合肥华德利科学器材有限公司)；RE-52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣仪器设备有限公司)；81M/SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵(巩义市科瑞仪器有限公司)；FA2004型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)；WFH-203B暗箱式三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；P-1型薄层色谱双槽层析缸(上海垒固仪器有限公司)；牛津杯(南京泰勒生物仪器有限公司)。

噻唑蓝[3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide,MTT]购自美国Amresco公司；氯霉素、制霉菌素购自上海瑞楚生物科技有限公司；GF254薄层硅胶板购自青岛海浪硅胶干燥剂有限公司；甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷等均为国产分析纯。

1.2指示菌白色念珠菌(Candidaalbicans)，皖南医学院微生物学与免疫学教研室提供。

1.3培养基分离养基：蛋白胨 5 g，葡萄糖 10 g，磷酸二氢钾 1 g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5 g，琼脂 20 g，氯霉素 0.1 g(乙醇溶)，水 1000 mL。液体发酵培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，酵母浸粉10 g，水 1000 mL。固体培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂20 g，酵母浸粉10 g，水 1000 mL。半固体培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，琼脂10 g，酵母浸粉10 g，水 1000 mL。

1.4方法

1.4.1土壤真菌分离、纯化及形态学鉴定采用稀释涂布平板法[6]，取土样稀释程度为10-3、10-4、10-5各200 μL涂布到分离培养基上，每个浓度重复1次，将平板倒置于28 ℃霉菌培养箱中培养5 d。利用固体培养基对分离的真菌进行纯化培养，保存待筛。并依据参考文献[7-8]，对筛选后活性菌株进行形态学鉴定。

1.4.2抗真菌活性菌株筛选

1.4.2.1活性菌株代谢产物粗提物样品制备采用液体培养基，将纯化待筛的菌株接种于装液为200 mL的500 mL 三角摇瓶中，静置于28 ℃霉菌培养箱中培养20 d。采用真空抽滤法将菌丝与发酵液分离，滤液50 ℃减压旋转蒸发浓缩至20 mL、4 ℃保存待测。

1.4.2.2杯碟法筛选活性真菌无菌操作台内，以白色念珠菌为指示菌，将白色念珠菌菌苔刮入无菌水后，配成108个/mL 的菌悬液。取该菌悬液200 μL均匀涂布于固体平板培养基上。用镊子夹取牛津杯放置平皿菌层上，加入待测样品(样品量与杯面平齐为准)。最后将平皿放入37 ℃ 恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径的大小，以确定样品抑菌活性。

1.4.3薄层色谱-生物自显影技术分离筛检活性菌株中活性成分

1.4.3.1活性菌株薄层色谱样品准备利用液体培养基对活性菌株进一步放大到1000 mL进行培养，取滤液50 ℃减压旋转蒸发浓缩至200 mL，用乙酸乙酯等体积萃取2次，合并萃取液，并分别对乙酸乙酯相和水相进行减压旋转蒸发浓缩至干，加少许甲醇溶解，并采用杯碟法以甲醇为空白对照，测试水相和乙酸乙酯相抗菌活性。

1.4.3.2薄层色谱层析展开剂筛选与优化参照文献[9]方法，选择和优化展开剂。

1.4.3.3薄层色谱-生物自显影技术筛检抗真菌活性成分以2 mg/mL的制霉菌素甲醇溶液为阳性对照，对提取物点样进行薄层层析展开，自然挥发干，其中一块薄层板5%浓硫酸乙醇105 ℃显色下观察各成分分离情况。另一块薄层板，无菌条件下，置入无菌直径为13 cm平皿中，并将半固体培养基倒入其中，使培养基高出硅胶板面2 mm，待培养基在硅胶板凝固后，取108个/mL浓度的指示菌，采用玻璃喷壶向其表面喷洒指示菌，之后将平皿置于4 ℃冰箱放置2 h以利于抗菌物质扩散。然后于37 ℃培养箱中培养24 h后，取出，向上面喷施外源显色剂噻唑蓝30 min后，观察并拍照实验结果。

2结果

2.1抗真菌活性菌株筛选体外杯碟法抑菌实验表明，分离的真菌中有一株真菌代谢物对指示菌白色念珠菌具有较强的抑制作用，抑菌圈分别为20.5 mm，结果如图1A所示，命名为F1。

A：初筛实验结果；B：提取物抑菌效果，1为发酵液乙酸乙酯相、2为水相、3为对照组甲醇相。

图1F1提取物对白色念珠菌抑菌效果

2.2活性菌株分离、纯化及鉴定利用固体培养基对F1进行培养1周，菌落直径为7.5 cm左右，菌丛白色如棉絮，高度4 mm，菌落底部呈花瓣状叠加，不产生色素(见图2)；菌丝无假根，孢囊单生，繁密呈松絮状，孢子囊顶生，呈球形，囊轴灰色，内含孢子呈椭圆形，同宗配合，生接合孢子(见图3)。经形态分类学鉴定，该F1与毛霉属(MucorMicheiexFries)、多籽毛霉(M.parvisporusKanouse)形态描述相似。

2.3展开剂筛选与优化经杯碟法抑菌实验比较了F1水相和乙酸乙酯相甲醇溶解物的抗菌效果，结果表明，乙酸乙酯相的活性明显好于水相，抑菌圈分别为23.8 mm和15.5 mm，甲醇对照组没有出现抑菌圈，结果如图1B所示。因此，选择乙酸乙酯相作用薄层色谱分离对象，并对展开剂系统进行选择优化，采用5%浓硫酸乙醇105 ℃显色分析，获得效果比较理想的展开溶剂系统即甲醇∶三氯甲烷=1∶4，结果如图4A所示。

A：正面图；B：反面图。

图2F1培养特征

图3F1孢子囊与接合孢子形态(×400)

2.4薄层色谱-生物自显影技术分离筛检活性菌株中活性成分以制菌霉素为阳性对照，展开剂为甲醇∶三氯甲烷=1∶4，对乙酸乙酯相进行展开分离，其中一块5%浓硫酸乙醇105 ℃显色，结果如图4A所示。另一块等溶剂挥发后，进行抑菌实验，结果如图4B所示，指示菌对制霉菌素耐药，没有出现被抑制现象，而F1乙酸乙酯相具有2个明显的活性成分，Rf值分别在0.15和0.6，提示Rf=0.15的活性成分极性相对较大，分离显色结果推断可能为单一成分，而Rf在0.6活性组分极性相对较小，从分离显色效果看，效果也不是非常理想，相比于Rf为0.15组分，活性也相对较低。

A：5%H2SO4-乙醇处理加热显色TLC结果；B：提取物对白色念珠菌抑菌效果TLC结果；Ext：提取物乙酸乙酯相；CK+：制霉菌素阳性对照。

图4薄层层析-生物自显影法检测F1提取物中抗菌成分

3讨论

为有效筛选出土壤中具有抗真菌活性菌株及其中的抗菌活性成分，选择土样和简单、灵敏、适用的活性筛选模型是成功的关键。本实验结合以往文献报道和腐生真菌的生境，随机选取了湿度适中、有机质相对较为丰富的土壤样品，采用稀释涂布平板法分离纯化并以杯碟法为活性菌株的初筛模型，以白色念珠菌为指示菌，筛选出具有抗真菌活性的菌株1株，又采用薄层层析-生物自显影法作为活性菌株的复筛模型及其抗真菌活性组分的模型[10]。为了较全面了解活性菌株抗真菌活性，防止活性组分漏筛，采用活性追踪方法，先对活性菌株发酵液进行乙酸乙酯萃取，将其分为水相和乙酸乙酯相，经低温减压浓缩甲醇溶解后再进行活性比较；在此基础上进行活性复筛，较以往对每一种成分进行分离，再逐一生物活性测定，工作量减少了很多。结果表明，在展开剂为甲醇∶三氯甲烷=1∶4下活性菌株乙酸乙酯分离到2个具有明显抑制白色念珠菌的活性成分，Rf值计算结果表明其中一个活性物质极性较低，Rf为0.6；另一个活性组分Rf为0.15，极性较大。因此，薄层层析-生物自显影法对活性菌株代谢产物中抑菌活性组分的筛选测定提供了快速便捷的测试模型，也为后期柱层析分离提供参考基础。

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Isolation and identification of an antifungal mucor and antibacterial activity test

CHENG Qunxian，SUN Fuqin， WU Fangfang， ZHANG Yu， WANG Ya， YANG Cheng

College of Clinical Medicine， Wannan Medical College，Wuhu 241002,China

【Abstract】Objective：To isolate and identify an antifungal mucor,and test its antibacterial activity.Methods：Dilution spread plate method was used to isolate the fungi from soils,and plate method was applied to determining the antifungal activity of fermentation broth.The strain was identified in compliance with the morphology and spore configuration.Thin-layer chromatography-bioautography assay was performed to detect antibacterial compound in the isolated fungi.Results：One strain mucor capable of inhibiting the growth of C.albicans with an inhibition diameter of 20.5 mm was obtained by initial morphological identification.Two antimicrobial components were extracted in ethyl acetate with expand system of methanol and chloroform(ratio:1∶4),and showed inhibitory activity against C.albicans.The retardation factor(Rf)value was 0.15 and 0.6,respectively.Conclusion：The mucor,an extraction with ethyl acetate,yields active compound against C.albicans.

【Key words】mucor; Thin-layer chromatography; bioatuography; antibacterial component; detection

文章编号：1002-0217(2016)03-0294-03

基金项目:安徽省大学生创新创业计划训练项目(Ap01410368083)

收稿日期：2015-11-12

作者简介：程群仙(1993-)，女， 2012级临床医学专业本科生，(电话)18356975969，(电子信箱)1058969710@qq.com；

【文献标识码】【中图号】R 392.33A

·大学生科技园地·

杨成，男，副教授，(电子信箱)yangcheng2003@126.com，通讯作者.