泰国输华斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测与分析

于　力，刘　莹，郑晓聪，王津津，贾　鹏，何俊强，刘　荭（深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳　518045）



泰国输华斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测与分析

于力，刘莹，郑晓聪，王津津，贾鹏，何俊强，刘荭
（深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳518045）

摘要：为研究进口斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒（Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus， IHHNV）的风险，本文采用了世界动物卫生组织（OIE）2015版手册中推荐的PCR方法，对2015年从泰国输华的329批次斑节对虾进行了IHHNV检测分析。结果发现，其阳性率高达36.8%，且主要是感染1型和2型，以及风险不明的未知型。因此，来自泰国的斑节对虾具有较高的IHHNV传入风险，应加强针对IHHNV的进口监测，减少其对我国对虾养殖的影响。

关键词：传染性皮下和造血器官坏死病毒；斑节对虾；未知基因型；风险

对虾传染性皮下和造血器官病是养殖对虾的重要疫病，可引起极高的死亡率（＞90%）［1-2］或生长发育畸形［3-4］，对世界对虾养殖业具有严重影响。世界动物卫生组织（OIE）将其列入须通报疫病。其病原是传染性皮下和造血器官病毒（IHHNV），其宿主为斑节对虾（Penaeus monodon）、南美白对虾（P. vannamei）和南美蓝对虾（P. stylirostris）等。

IHHNV属于细小病毒科［5］，是已知最小的对虾病毒。病毒粒子大小为20～22 nm，基因组为单链DNA，长约3.9 kb［6-7］。该病毒至少有3个基因型，其中1型主要分布在美洲和东亚，2型主要分布在东南亚，这两种基因型均为感染型［8-9］。3型又分为3A型和3B型，其中3A型主要分布在东非、印度和澳大利亚等地区，而3B型则主要分布在印度太平洋地区。3A型和3B型将部分基因序列嵌入宿主对虾的基因组，但不具备感染性［10］。

本研究采用了2015版OIE手册推荐的PCR方法，对2015年从泰国输华的斑节对虾进行了检测，同时进行了流行病学调查与风险分析。

1　材料与方法

1.1样品与对照

样品为2015年从泰国进口到中国的活斑节对虾，共329批次，均无发育畸形等典型临床症状。取样部位为鳃和皮下组织。阳性对照为本实验室保存的IHHNV阳性组织，阴性对照为健康的斑节对虾组织。

1.2引物合成

引物采用2015版OIE手册推荐的PCR引物，详见表1，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1　IHHNV检测引物

1.3DNA提取

将采集的鳃组织匀浆后提取DNA。本实验用到的组织均使用QIAamp DNA Mini QIAcube Kit （QIAGEN）进行DNA提取。

1.4PCR检测

使用Ex Taq（TAKARA）进行PCR检测，引物终浓度为400 nM。根据OIE手册（2015版），先使用392F/R引物对所有样品进行检测。若有阳性，则使用309F/R与MG831F/R引物进行分型。以上3对引物的PCR反应程序均为95 ℃ 5 min，35个循环（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），72 ℃ 7 min。

1.5电泳与测序

PCR产物使用毛细管电泳仪QIAxcel （QIAGEN）来分析，阳性样品送华大基因进行测序，与NCBI BLAST后，相似度95%以上确定为阳性。

2　结果

2015年从329批斑节对虾中，共检出IHHNV阳性121批，阳性率为36.8%。按照OIE手册（2015版），引物392F/R能检出IHHNV的所有基因型，而引物309F/R能检出1型和2型，MG831F/R能检出3A和3B型。若392F/R引物阳性，而309F/ R和MG831F/R均为阴性，则无法判断其基因型，本文暂称为未知型（图1）。检测结果汇总如表2与图2所示。使用卡方检验，季度之间阳性率无显著差异（P＞0.05）。IHHNV各基因型所占的百分比例如图3所示。

图1　IHHNV未知型电泳

表2　2015年泰国输华斑节对虾IHHNV检测结果

图2　泰国输华斑节对虾IHHNV按季度检测结果

2015年第一、二季度的IHHNV阳性率相对较低，第三、四季度相对较高。每个季度的基因型主要为未知型和1/2型，而3A/3B以及1/2和3A/3B型共存的所占比较很小。

泰国2015年输华斑节对虾的IHHNV各基因型所占的百分比中，1型/2型所占比例最大，为47%；未知型占44%；3A/3B型占6%；1型/2型和3A/3B型占3%（图3）。

图3　泰国输华斑节对虾IHHNV基因型分布

3　讨论

本研究采用了OIE手册（2015版）推荐的PCR方法，对2015年从泰国输华的斑节对虾进行了IHHNV检测分析。结果表明，总体阳性率高达36.8%，说明IHHNV感染的斑节对虾未必会表现出临床症状，这与OIE手册所介绍的情况一致。阳性样品中主要是感染1型和2型，以及未知风险的未知型。有研究发现，斑节对虾对IHHNV感染具有较高的耐受性［11］，这也与该实验结果相符，说明IHHNV对斑节对虾致死率低，使其成为携带与传播IHHNV的风险［12］。从季节而言，第一、二季度的IHHNV阳性率相对较低，而第三、四季度相对较高，但无显著差异，可能是由偶然因素或波动所引起的。

关于未知型，在OIE手册中未见相关描述，相关文献也未有提及。但有文献指出IHHNV的基因变异率较高［13］，且现行方法无法区分出所有的基因型［14］。因此未知型可能是IHHNV的突变型，或者是由于现行方法的局限未能区分出的基因型，所以对其感染性以及风险未知。因此对于IHHNV未知型的样品应该谨慎处理，同时也应对其进行深入研究。

本研究还观察到4批1型/2型和3A/3B型共存的现象，这与Tang等［15］观察到的现象一致，说明即使确认了非感染型IHHNV，也不能排除其含有感染型的可能。所以在实际检测工作中应同时使用309F/R和MG831F/R引物进行分型分析。

综上所述，来自泰国的斑节对虾具有较高的传入IHHNV风险，且未知风险的未知基因型占有近一半的比例。即使斑节对虾本身对IHHNV耐受，但也可能将其传播给其他易感对虾，造成极高的死亡率。我国是对虾养殖大国，同时也从东南亚进口大量对虾，因此应加强IHHNV的进口监测，以更好地防控该病，减少其对我国对虾养殖的影响。

参考文献：

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［9］ Tang K F J，Poulos B T，Wang J，et al. Geographic variations among infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV） isolates and characteristics of their infection［J］. Dis Aquat Org，2003，53：91-99.

［10］ Tang K F J， Lightner D V. Infectious hypodermal and

hematopoietic necrosis virus（IHHNV）in the genome of the black tiger prawn Penaeus monodon from Africa and Australia［J］. Virus Res，2006，118：185-191.

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［12］ Toms C J，Roswin J L，Anbu R，et al. Occurrence of viral pathogens in Penaeus monodon post-larvae from aquaculture hatcheries［J］. Data Brief，2015（4）：170-176.

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［15］ Tang K F J，Navarro S A，Lightner D V. A PCR assay for discriminating between infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus （IHHNV） and the virus-related sequences in the genome of Penaeus monodon［J］. Dis Aquat Org，2007，74：165-170.

（责任编辑：朱迪国）

Test and Analysis of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus on Penaeus monodon Imported from Thailand

Yu Li，Liu Ying，Zheng Xiaocong，Wang Jinjin，Jia Peng，He Junqiang，Liu Hong
（Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

Abstract：In order to study the risks of Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus（IHHNV） of imported Penaeus monodon，PCR methods recommended by OIE manual（2015）were used to test IHHNV on 329 batches of Penaeus monodon imported from Thailand. The results showed that positive rate was 36.8%，and major genotypes were genotype 1 ，2 and unknown type with unclear risk. Therefore，the IHHNV risk of P. monodon imported from Thailand is high. Suggestions of reinforcing the surveillance of 1HHNV to control this disease and limit the negative effect on shrimp aquaculture of China were put forward.

Key words：IHHNV；Penaeus monodon；unknown genotype；risks

中图分类号：S851.34

文献标识码：A

文章编号：1005-944X（2016）06-0083-04

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.024

基金项目：国家质检总局科技计划项目（2010IK007）

通讯作者：刘 荭