小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

王昌建，邹玖零，何世成，王卫国，唐小明，林　源，鲁杏华，邱立新（.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙　4004；.永州市动物疫病预防控制中心，湖南永州 45000）



小反刍兽疫病毒荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

王昌建1，邹玖零2，何世成1，王卫国1，唐小明1，林源1，鲁杏华1，邱立新1
（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙410014；2.永州市动物疫病预防控制中心，湖南永州 425000）

摘要：为建立小反刍兽疫病毒（PPRV）快速荧光RT-PCR检测方法，应用DNAstar软件对来自NCBI上的PPRV N基因序列进行比对分析，在保守区设置引物和探针，经条件优化，建立PPRV荧光RT-PCR检测方法。结果显示，该方法灵敏度高、特异性好、稳定性强，阳性结果与商用试剂盒的检测结果一致。结果表明该方法可用于PPRV的实验室检测。

关键词：小反刍兽疫病毒；荧光RT-PCR；检测

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）又称小反刍兽假性牛瘟，病原为副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒（PPRV）。该病毒主要感染小反刍兽，其中山羊和绵羊最易感，偶有野生动物感染［1］，目前未有人感染的报道。PPR一般发生在多雨、干燥、寒冷季节［2］。羊群发病率一般高达100%，严重时病死率可达100%，轻度发生时，病死率不超过50%［3］。PPRV可以通过直接接触和空气传播［4］。

PPRV基因组为单股负链无节段RNA，有N-PM-F-H-L 6个基因［5］。其中N基因编码N蛋白（核衣壳蛋白）。该蛋白的主要作用是保护病毒免受RNA核糖核酸酶的降解。传统的病毒分离检测方法耗时长，而琼扩实验及ELISA实验，不仅灵敏度低，还无法区分PPRV和牛瘟病毒（RPV）。近年来，荧光RT-PCR分子生物学技术飞速发展，为PPR快速检测提供了可能。本研究旨在建立一种快速、特异、准确、灵敏的PPRV荧光定量RT-PCR检测方法。

1　材料与方法

1.1材料

PPR野毒为经国家外来动物疫病研究中心确诊的临床阳性组织样品；FMDV标准品为灭活后的FMDV病毒培养物，来自兰州兽医研究所；PPR弱毒苗（Nigeria75/1）为新疆天康畜牧生物技术股份有限公司产品；犬瘟热疫苗为法国梅里亚公司产品；羊口疮疫苗为山东泰丰生物技术有限公司产品。临床样品来自湖南各市州的20份临床疑似PPRV组织病料样品。

1.2主要试剂及仪器

核酸提取试剂盒（磁珠法），购自天隆科技；One Step PrimeScript RT-PCR Kit，购自TaKaRa -宝生物工程（大连）有限公司；PPRV一步法荧光定量RT-PCR检测试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；PPRV通用荧光定量RT-PCR检测试剂盒，购自国家外来动物疫病研究中心。其他仪器：ABI7500实时荧光PCR仪、天隆科技核酸提取仪、美国NANOVUE微量紫外分光光度计。

1.3病毒RNA提取

将组织样品前处理后，用全自动核酸提取仪提取RNA核酸；用紫外分光光度计测RNA的浓度；将已知浓度的RNA，依次进行10倍梯度稀释，共稀释9个梯度，-70 ℃保存，作为模板备用。

1.4引物和探针的设计

将GenBank中已公布的PPRV N基因进行序列比较分析（表1），选择保守序列，设计荧光RTPCR引物和Taqman探针，并用Blast比对引物和探针特异性后，送上海生工生物工程股份有限公司合成并标记。具体序列及扩增长度见表2。

表1　参考基因序列明细

表2　荧光RT-PCR引物和探针序列

1.5荧光定量RT-PCR检测方法的建立

参照TaKaRa公司的One Step PrimeScript RTPCR Kit说明书，以提取的RNA为模板，进行荧光定量RT-PCR反应。20 uL反应体系配制如下：2×buffer 10 uL，Ex TaqTM HS 0.4 uL，Prime Script RT Enzyme MixⅡ 0.4 uL，N-R1（20 uM）0.2 uL，N-F1（20 uM）0.2 uL，N-P1 （20 uM）0.4 uL，50×ROX 0.4 uL，RNA模板5 uL，补水至20 uL。反应条件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。

1.5.1反应条件优化。参照TaKaRa公司的One Step PrimeScript RT-PCR Kit说明书，以提取的RNA为模板进行荧光定量RT-PCR反应，对引物和探针浓度进行方阵实验筛选最优浓度，以获得最小CT值和最大荧光信号为最佳浓度。

1.5.2灵敏度实验。将10倍梯度稀释的RNA，自高到低依次作为模板进行荧光定量RT-PCR反应，设立空白阴性对照，确定该方法的最低检测浓度。

1.5.3重复性和稳定性实验。选取病毒RNA的10-3、10-4、10-5等3个梯度，在同一次反应中每个样重复3次，进行组内重复性实验；每隔1周进行1次反应，共计3次，作为组间重复性实验；两组实验均设阴性对照，并统计变异系数。

1.5.4特异性实验。将分别提取的PPR野毒、PPR疫苗毒、FMDV、犬瘟热疫苗毒及羊口疮疫苗毒核酸作为模板进行特异性实验，同时设立阴性对照。

1.5.5与普通RT-PCR的检测灵敏度比较。选取100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等7个稀释度，比较普通RT-PCR方法与本研究建立的荧光RTPCR方法的灵敏度。

1.5.6临床样品的检测。对湖南部分地区送来的20份疑似PPRV病料组织提取RNA，用已经建立的荧光定量RT-PCR方法进行检测，并与实验室商品试剂盒检测方法比较各自检出率。

2　结果

2.1反应体系的优化

选用4、6、8 pmol/uL的引物和6、8、10 pmol/ uL的探针，用方阵法筛选反应的最佳引物和探针的搭配浓度。实验结果表明，当引物为6 pmol/ uL、探针为8 pmol/uL时，有最小CT值和最佳扩增曲线。结果见图1。

图1　条件优化扩增曲线

优化后的反应程序如下：2×buffer 10 μL，Ex TaqTM HS 0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ 0.4 μL，N-F1（20 μM）0.3μL（6 pmol/ μL），N-R1（20 μM）0.3 μL（6 pmol/μL），N-P1（20 μM）0.4 μL（8 pmol/μL），50×ROX 0.4μL，RNA模板5 μL，补水至20 μL，反应条件：42 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。

2.2灵敏度实验

对测得浓度为357.6 mg/L的RNA模板进行10倍梯度稀释（10-1～10-9）后，进行荧光定量RT-PCR反应，结果表明该方法可以检测到的最低稀释度为10-6，即RNA浓度为357.6×10-6mg/L时也可以检测到，其中稀释度为10-7的检测结果为可疑。结果见图2。

图2　敏感性扩增曲线

2.3重复性和稳定性实验

对10-3、10-4、10-5梯度，每个梯度重复3次，进行组内重复性实验。结果阴性对照未出现特异性扩增，同一梯度的扩增曲线重合性较好（图3）。各梯度变异系数见表3，组间重复性实验结果见表4。结果显示该方法的重复性和稳定性都较好，可以进行稳定、可靠地检测。

图3　组内重复性扩增曲线

表3　组内重复性实验

表4　组间重复性实验

2.4特异性实验

用本研究建立的PPR荧光定量RT-PCR方法对PPR野毒、PPR疫苗毒、FMDV、犬瘟热疫苗毒及羊口疮疫苗毒核酸进行检测。结果显示，该方法对PPR野毒和疫苗株，均可检测出特异性扩增曲线，对其他病毒及阴性对照的检测结果均为阴性，表明本研究建立的方法特异性好，可以用于通用型PPRV的检测（图4）。

图4　特异性扩增曲线

2.5与普通RT-PCR方法的灵敏度比较

普通RT-PCR的检测结果表明（图5），稀释度为10-4时有特异性条带扩增，往后的稀释度无特异条带，说明该方法最低可以检测到10-4稀释度的RNA。而本研究建立的荧光定量RT-PCR可以检测到10-6稀释度的RNA，是普通RT-PCR检测灵敏度的100倍。

2.6临床样品的检测

用建立的荧光RT-PCR方法与两种商用荧光RT-PCR检测试剂盒，对20份临床疑似PPR组织病料进行同时检测。结果显示，建立的荧光RT-PCR方法检测结果中，有11个样品为阳性，与两种商用荧光RT-PCR检测试剂盒的检测结果一致，符合率为100%。

图5　敏感性实验

3　讨论

经过国内外学者对PPR的广泛研究，目前已建立了病毒分离、琼脂免疫扩散实验、酶联免疫吸附试验、RT-PCR及荧光RT-PCR等多种检测PPR的方法［6-7］。基于PPR对我国的危害，建立灵敏、特异、快速、准确的PPR诊断方法，是防控该病的当务之急。聚合酶链式反应技术比其他检测方法的特异性和灵敏度都要高，目前已广泛应用于病原学的快速诊断。Forsyth 等首次建立了PPRV和RPV的RT-PCR 鉴别诊断方法；Couacy-Hymann［8］等建立了检测PPRV的RT-PCR方法，但该方法分两步进行，容易污染，且耗时长。Balamurugan［9］等建立了检测PPRV的一步RT-PCR方法，解决了易污染和假阳性问题，但不能直接观察实验结果。国内也有学者建立了RT-PCR方法对PPRV进行检测。姚李四［10］等建立了一步RT-PCR方法检测PPRV。毛立［11］设计了一对特异引物和一对内参引物，建立了特异检测PPRV的RT-PCR方法，但要通过电泳后观察结果，且灵敏度不如荧光RT-PCR方法。包静月［12］在普通RT-PCR的基础上，通过设计引物和Taqman探针，建立了一步法实时荧光定量RT-PCR方法。该方法灵敏度高、特异性好，但耗时较长。本研究建立的荧光RT-PCR方法可在1 h内得到检测结果，适用于实验室的快速检测，但试剂组分过多，配置过程繁琐易出错。

本研究选择N基因高度保守区设计探针，并在探针上下游设计引物，建立了检测PPRV的一步荧光RT-PCR方法。设计的特异性探针与来自多个地区的PPRV毒株都匹配，探针的Tm值为69.5 ℃，比引物的Tm值高出约10 ℃，保证了探针在退火时先于引物与目的片段结合，且引物和探针都没有二级结构，确保了反应的特异性和高效性。试验发现，所建立的荧光RT-PCR方法特异性强，仅检测到PPR疫苗毒和野毒，对FMDV、羊口疮、犬瘟热病毒均没有扩增反应。重复性实验和稳定性实验发现，变异系数均不超过5%，具有良好的重复性和稳定性。对20份临床疑似样品检测发现，本研究建立方法的检测结果与世纪元亨公司及国家外来动物研究中心PPRV荧光RT-PCR检测试剂盒一致，表明本研究建立的PPRV荧光RT-PCR方法可以有效检测PPR，适合临床应用。

参考文献：

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［6］ Sumption K J，Aradonm G，Libeau G . Detection of peste des petits ruminants virus antigen in conjunctival smears of goats by indirect immunofluorescence［J］ . Vet Rec，1998，142 （16）：421-424.

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［10］ 姚李四，陈颖，徐宝梁，等. RT-PCR检测小反刍兽疫病毒核酸方法的建立［J］. 中国动物检疫，2006，23（5）：19-20.

［11］ 毛立，窦永喜，翟军军，等. 小反刍兽疫病毒RT-PCR检测方法的建立［J］. 中国兽医科学，2010，40（6）：593-597.

［12］ 包静月，李林，王志亮，等. 一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立［J］. 中国动物检疫，2007，24（8）：21-23.

（责任编辑：朱迪国）

Establishment and Application of Fluorescence RT-PCR Detection Method for Peste des Petits Ruminants Virus

Wang Changjian1，Zou Jiuling2，He Shicheng1，Wang Weiguo1，Tang Xiaoming1，Lin Yuan1，Lu Xinghua1，Qiu Lixin1
（1.Hunan Animal Disease Prevention and Control Center，Changsha，Hunan 410014；2.Yongzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Yongzhou，Hunan 425000）

Abstract：In order to establish a rapid fluorescence RT-PCR assay for detection of Peste des Petits Ruminants virus （PPRV），PPRV N gene sequences from NCBI were analyzed by DNAstar software. A pair of primers and a probe at the conservative site were designed. After optimization of conditions，the PPRV fluorescence RT-PCR detection method was established. The results showed that the method was of high sensitivity，good specificity and good stability. The results of positive samples were consistent with commercial kits，indicated that this method could be used for PPRV detection in laboratory.

Key words：PPRV；fluorescence RT-PCR；detection

中图分类号：S852.695.5

文献标识码：A

文章编号：1005-944X（2016）06-0072-06

DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2016.06.021

通讯作者：邹玖零