Axin基因对人肾母细胞瘤细胞生物学特性的影响*

西安市儿童医院病理科(西安 710002)　陈广生　安　鲁　李　娟　张　强　惠军朋



·临床病理·

Axin基因对人肾母细胞瘤细胞生物学特性的影响*

西安市儿童医院病理科(西安 710002)陈广生安鲁李娟张强惠军朋

摘要目的：研究Axin基因对人肾母细胞瘤细胞G401生物学特性的影响为人肾母细胞瘤的分子病理机制及治疗、预后提供基础研究依据。方法：采用基因工程的方法构建含 Axin基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-Axin，稳定转染G401细胞，建立高表达的G401细胞系。用MTT实验、克隆形成能力实验、侵袭能力实验三种方法检测 Axin基因对G401细胞生物学特性的影响。结果：重组载体pIRES2-EGFP-Axin经PCR和双酶切鉴定结果显示：在约2500 bp大小处出现一条特异性条带，转染G401细胞后，经Western blotting结果显示：Axin蛋白在G401细胞中成功表达，同时，转染了pIRES2-EGFP-Axin质粒的G401细胞生长速度显著减慢(P<0.05)；G401细胞的克隆形成能力和侵袭力均显著降低(P<0.05)。结论：我们成功构建了重组真核表达载体PIRES2-EGRP-Axin，且通过Western blotting 检测筛选获得稳定转染的G401细胞系，最后Axin体外实验对G401细胞生物学特性影响表明：Axin基因与肾母细胞瘤的发生发展有一定关系。

主题词肾母细胞瘤/治疗基因/治疗应用细胞分裂@ Axin@ G401

在1997年对天然突变系小鼠基因分析中发现了基因Axin (Axis formation inhibition)[1]。 由于Axin能够下调β-catneni的水平而被视为一种肿瘤抑制因子[2]。 后来人们发现了与Axin同源的蛋白，为Conductin(又称Axi l和Axin 2)，与Axin有着相似的生物学功能[3]。Axin与许多人类肿瘤的发生发展有着密切的关系。肾母细胞瘤(Nephroblastoman)是婴幼儿最多见的恶性实体瘤之一，具有较高的致死率，是导致儿童因肿瘤死亡的主要肿瘤之一 ，其发病原因目前尚不清楚，但有证据表明肾母细胞瘤的形成可能与一定的内环境改变和基因变异有关。有关Axin在肾母细胞瘤发生发展中的作用及其机制研究，在国内外尚未见相关研究。国外研究发现：在儿童肾母细胞瘤中发现有Axin1基因的缺失或突变或杂合性消失，提示Axin基因与肾母细胞瘤的发生发展有一定关系[4]。本研究拟通过初步探索Axin对人肾母细胞瘤生物学特性的影响，来探讨Axin在肾母细胞瘤发生发展中的作用及分子机制，为肾母细胞瘤的生物治疗提供依据。

材料与方法

1材料与试剂人肾母细胞瘤细胞株G401由西安市儿童医院病理科提供；质粒 pIRES2-EGFP 、真核转染试剂Lipofectamine 2000由Invitrogen公司提供； NheI、 SalI购于TaKaRa公司； PCR引物由上海生工合成；其余试剂均由西安晶彩生物科技有限公司提供。

2实验方法

2.1PCR引物设计和真核表达载体的构建：根据GenBank公布的小鼠Axin基因的序列，设计全长引物，P1(上引): 5′-GCGGCTAGCAT GCAGAGTCCCAAAATGAAT-3′含有NheI的酶切位点(划线部分)和启始密码；引物 P2(下引): 5′-GCAGTCGACTCAGTCCACCTTTTCCACCTT-3′含有SalI的酶切位点(划线部分)及终止密码子。以pCMV5-HA-Axin质粒为模板，用P1和P2引物扩增Axin基因的全长，将基因Axin纯化的PCR产物经NheI和SalI酶切，克隆至pIRES2-EGFP质粒，转化大肠杆菌DH5α，卡那霉素平板筛选阳性克隆，命名为pIRES2-EGFP-Axin。小量提取阳性克隆菌质粒，以NheI与SalI酶切鉴定，测序由上海生工完成。

2.2真核载体pIRES2-EGFP-Axin转染高表达的G401细胞并筛选稳定的细胞系：细胞用RPMI 1640培养基(含10%小牛血清)在37℃、5% CO2浓度条件下培养。转染前24 h将处于对数生长期的细胞重新接种于6孔板(瞬时)和24孔板(稳定)中，贴壁细胞在长满底面积80%时进行转染。转染按照LipofectamineTM2000试剂说明书操作。于转染后48 h收集6孔板内细胞，作为瞬时转染细胞表型鉴定用。于转染后72 h按1∶10比例传代于60 mm直径培养皿中，然后加入适量(400～2000 μg/ml)G418进行筛选，两周后挑取单个细胞集落，扩大培养，然后作为稳定转染细胞表型鉴定用。

2.3Western blotting鉴定：Axin蛋白在G401细胞中的表达：蛋白提取RIPA裂解液试剂盒购于西安晶彩生物科技有限公司, 采用BCA法测定样品蛋白质的浓度，确定相同上样量所需体积数。SDS-PAGE及Westren blotting：采用SDS-PAGE不连续系统进行电泳.电泳结束后将与凝胶电泳大小一致的6张滤纸和1张PVDF膜浸入转移缓冲液中5～10 min，凝胶置负极，PVDF膜正极，滤纸覆盖，排除气泡。湿转法恒压为80V转印约1.5 h，转膜结束膜用立春红染色，标记蛋白Marker条带。膜于TBS中漂洗15 min，脱脂奶粉37℃封闭2 h。封闭结束后加入一抗，4℃过夜。TBST洗涤三次后加入相应HRP标记二抗室温作用1 h，TBST充分洗涤后ECL化学发光系统显色，压片，曝光，显影，定影后晾干保存。

2.4噻唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线：用0.25%胰蛋白酶消化转染含Axin表达质粒细胞以及转染空质粒细胞，按每孔600个细胞接种于96 孔培养板，37℃、5% CO2孵箱中孵育，每天取出一96孔板加MTT溶液(5 mg/ml)20μl，37℃，孵育4 h后，弃上清，每孔加入150μl DMSO，震荡10 min， 使结晶物充分溶解；测定490 nm 处测OD值，绘制细胞生长曲线。

2.5克隆形成实验检测细胞克隆形成能力：0.25%胰蛋白酶消化转染含Axin表达质粒细胞以及转染空质粒细胞，制备细胞悬液，按每孔100个细胞接种于六孔板中。37℃、5% CO2孵箱中静止培养2～3周，克隆形成后用Giemsa染色30 min ，计数直径>1mm 的克隆细胞数目。

2.6侵袭试验测试G401细胞的侵袭能力：将购于BD公司的人工基质胶Matrigel按每孔40 μl加入Transwell小室的聚碳酸酯膜(微孔滤膜孔径为8 μm)的上室面，在4℃进行风干，将细胞分为3组，无血清饥饿24 h后，胰酶消化，终止消化且离心后弃去培养基，PBS漂洗2遍，用无血清RPMI-1640培养基重悬细胞沉淀，稀释至密度为106/ml，取100 μl细胞液加入Transwell上室中，在下室中加入含10%血清培养基500 μl，24 h后，甲醇固定20 min，0.1%结晶紫染色15～20 min，轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将上室取出，从聚碳酸酯膜内侧面用吸水纸吸干水分，自然干燥， 测定前，将各实验组上室置入新的24 孔板中，每孔加0.6 ml 33%醋酸脱色，充分震荡，每组设定5 复孔；同时设置调零孔(33%醋酸)；比色：每孔取脱色液150 μl 加入96 孔板中，在570 nm 处测定OD 值。

结果

1pIRES2-EGFP-Axin真核表达载体的构建核酸电泳结果显示： Axin基因成功克隆至载体pIRES2-EGFP中，约在2500 bp处出现了一条特异性条带。重组质粒的PCR和双酶切鉴定如图1所示。

2Axin蛋白在人肾母细胞瘤细胞中的表达鉴定取转染72 h后的稳定转染细胞表型用Western blotting法进行鉴定Axin蛋白的表达。检测结果显示：正常的G401细胞和转染了空载质粒的G401细胞中均未检测到Axin蛋白的表达，只有转染了pIRES2-EGFP-Axin质粒的G401细胞中检测到了特异性的Axin蛋白条带(如图2所示)。

图1重组质粒pIRES2-EGFP-Axin的PCR和双酶切鉴定(M: DNA marker；1：重组质粒pIRES2-EGFP-Axin的PCR扩增；2：重组质粒pIRES2-EGFP-Axin的NheI与SalI双酶切)

图2β-actin在G401中的表达和Axin在G401中的表达的Western blotting(1、2：正常的G401细胞；3、4：转染空载质粒的G401细胞；5、6：转染质粒pIRES2-EGFP-Axin的G401细胞)

3MTT法绘制G401细胞的生长曲线来观察细胞的生长增殖能力见图3。①正常培养的人G401细胞；②转染pIRES2-EGFP质粒的G401细胞；③转染pIRES2-EGFP-Axin质粒的G401细胞。实验结果显示：Axin的表达使G401细胞的生长减慢，明显受到抑制，与①组和②组对照细胞组之间有显著性差异 (P<0.05)；而①组与②组之间无显著性差异 (P>0.05)。

4克隆形成能力实验结果见图4。对照组的细胞克隆数分别为：332 ± 9.8；331 ± 10.1，而转染了pIRES2-EGFP-Axin质粒的G401细胞克隆数显著减少为215± 9.6，与对照组比较具有显著性差异(P<0.05)。

5G401细胞侵袭试验见图5。以穿过Matrigel胶的细胞数来表示瘤细胞的侵袭力，本实验中采用测OD值的方法来间接的反应G401细胞的侵袭力。细胞的侵袭试验结果显示：对照组的细胞侵袭力分别为0.9896± 0.01；0.9798± 0.05。而转染了pIRES2-EGFP-Axin实验组的侵袭力显著降低到0.4783± 0.11(P<0.05)。

图3　不同实验组下细胞的生长曲线

图4　不同实验组下细胞的克隆形成能力

图5　不同实验组下细胞的侵袭能力

讨论

肾母细胞瘤是儿童发病率最高的恶性肿瘤[5]。有APC或PTCH(patched)基因突变的病人患病率较高[6]。最近在肾母细胞瘤中发现有Axin1基因的缺失或突变或杂合性消失，这些突变主要位于C末端第6～10个外显子处[7]。Axin自身二聚体的形成对抑制TCF的转录活性有很大影响[8]，在有APC、β-catenin 或Axin1突变的HCC或结肠癌细胞中野生型Axin1的表达可诱导细胞凋亡。在肿瘤中检测到Axin基因的缺陷以及腺病毒转染野生型Axin到Axin突变的癌细胞和APC突变的癌细胞，导致β-catenin的降解及细胞凋亡[9]，这些都进一步说明Axin是肿瘤抑制因子。通过导入野生型Axin或者APC可能成为治疗这些癌症的一种手段[10]。

本实验初步探索Axin基因对人肾母细胞瘤G401细胞生物学特性的影响。成功构建含有Axin基因的真核表达载体，Western blotting鉴定结果显示：Axin基因在G401细胞中成功表达。Axin基因对人肾母细胞瘤生物学影响的结果显示：转染pIRES2-EGFP-Axin质粒的G401细胞的增殖和生长，受到明显抑制，细胞的生长速度显著减慢；克隆形成能力实验表明：Axin蛋白在G401细胞中的表达影响其增殖能力，其克隆形成能力显著降低；G401细胞侵袭能力实验表明：转染含有Axin基因的质粒的G401细胞的侵袭能力显著低于对照组的G401细胞的侵袭能力。上述实验结果表明：Axin基因可抑制G401细胞的增殖、克隆形成能力和侵袭能力。提示：Axin可能会成为人肾母细胞瘤基因治疗的有效靶点。

参考文献

[1]Zeng L, Fagotto F, Zhang T,etal.The mouse Fused locus encodes Ax in, an inhibitor of the Wnt signaling path way that regulates embryonic axis form at ion [J] .Cell, 1997, 90(2): 181 -192.

[2]Taniguchi K,Roberts LR,Aderca I,etal. Mutational spectrum of -catenin,AXIN1and Axin2 in hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas [J].Oncogene，2002，21(31):4863-4871.

[3]Rennoll SA, Konsavage WM Jr, Yochum GS. Nuclear AXIN2represses MYC gene expression[J].Biochem Biophys Res Commun，2014 ，443(1):217-222.

[4]Yang LH, Han Y, Li G,etal. Axin gene methylation status correlates with radiosensitivity of lung cancer cells[J].BMC Cancer，2013，13(3):368.

[5]Tohmas E，Shamberger RC． Wilms tumor: Recent advances in clinical care and biology[J].Seminars in Pediat Sur，2012，21( 1) : 15-20．

[6]Rivera MN，Kim WJ，Wells J，etal． An X chromosome gene，WTX，is commonly inactivated in Wilms tumor[J]. Science, 2007，315( 5812) : 642-645.

[7]Major MB, Camp ND, Berndt JD,etal. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling[J]. Science，2007 ，316(5827):1043-1046.

[8]Fagotto F. Domains of axin involved in protein-protein interactions, Wnt pathway inhibition, and intracellular localization[J]. J Cell Biol，1999，145(4): 741-756.

[9]Mu YD, Xu Z, Contreras CI,etal. Mutational analysis of AXIN2, MSX1, and PAX9in two Mexican oligodontia families[J].Genet Mol Res，2013，12(4):4446-4458.

[10]Brauburger K, Akyildiz S, Ruppert JG,etal. Adenomatous polyposis coli (APC) membrane recruitment 3, a member of the APC membrane recruitment family of APC-binding proteins, is a positive regulator of Wnt-β-catenin signaling[J]. FEBS J，2014，281(3):787-801.

(收稿：2015-12-01)

【中图分类号】R737.11

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.05.049

Biological effects of Axin gene on human Wilms' tumor cells

Department of Pathology, Xi，an Children，s Hospital (Xi，an 710002)Chen GuangshengAn LuLi Juanet al

ABSTRACTObjective： Research effects of biological characteristics of Axin gene on human Wilms tumor cell G401 to molecular pathogenesis, treatment and prognosis of Wilms tumor provide basic research basis. Methods：Constructed eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP-Axin by genetic engineering methods, transfected stably G401 cell, establishing of G401 cell lines of high expression, By MTT assay, colony forming ability experiments and invasion experiment three methods detect effects of biological characteristics of Axin gene in G401 cell. Results：Recombinant vector pIRES2-EGFP-Axin by PCR and double digestion results showed that about 2500 bp appeared in a specific band, after transfected G401 cell, Western blotting results showed: Axin protein successfully expressed in G401 cell. Meanwhile MTT assay in vitro experiments showed that: transfected pIRES2-EGFP-Axin G401 cell growth slowed significantly(P<0.05), Colony formation and invasion experiment results also show: after transfected plasmid pIRES2-EGFP-Axin the G401 cell colony formation and invasion were significantly reduced(P<0.05).Conclusion：We successfully constructed the recombinant eukaryotic expression vector PIRES2-EGRP-Axin, and screened stably transfected cell lines through Western blotting analysis, the last Axin in vitro effects on the biological characteristics of G401 shows: a certain relationship between Axin gene with the occurrence and development of Wilms' tumor.

KEY WORDSNephroblastoma/therapyGene/therapeutic useCell division@Axin@G401

*陕西省自然科学基金资助(2010JM4026)