考马斯亮蓝法定量评估绿茶涩味强度

宋亚赛，宁井铭，张正竹，丁玎，方骏婷，宛晓春

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥，230036)



考马斯亮蓝法定量评估绿茶涩味强度

宋亚赛，宁井铭，张正竹，丁玎，方骏婷，宛晓春*

(安徽农业大学 茶与食品科技学院，茶树生物学与资源利用国家重点实验室，安徽 合肥，230036)

摘要苦涩味是构成绿茶滋味的重要因子，但缺乏客观的评价方法。文中对121个绿茶样品中主要化学成分进行主成分和因子分析，得到了F1：苦、F2：鲜、F3：涩、F4：酸和F5：爽5个滋味复合因子，并筛选出36个茶样进行定量感官涩味评估和考马斯亮蓝法测定。结果表明：5个滋味复合因子能很好地解释绿茶“苦涩、鲜爽”的呈味特点；唾液淀粉酶沉淀指数与鲜味因子得分呈显著负相关(P<0.05)，定量感官涩味得分与EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)呈显著正相关(P<0.01)，而唾液淀粉酶沉淀指数、定量感官涩味得分及涩味因子得分间相关性未达到显著水平，绿茶茶汤涩味的产生不仅与酚类物质对唾液蛋白的沉淀有关，可能还存在其他的影响因素。

关键词绿茶；涩味强度；定量评估；考马斯亮蓝法；唾液淀粉酶沉淀指数

涩味是口腔上皮细胞暴露在明矾或单宁溶液中，产生的一种干燥、收敛、粗糙的复合感觉[1]，适度的涩味被认为是构成绿茶口感与风味必不可少的因素之一[2]。研究表明，酯型儿茶素是形成绿茶苦涩味的主体成分[3-4]，咖啡碱、芦丁等具有增强酯型儿茶素涩味强度的作用[5]，而茶氨酸、谷氨酸等鲜味氨基酸被认为可以降低绿茶的苦涩感[2]。所以，绿茶茶汤的涩感是多种成分共同作用的结果，但其成分间相互作用的机理尚不明确。近年来，ALESSANDRA RINALDI等人通过SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)法测定红酒中酚类物质与唾液蛋白的结合沉淀反应，并利用SPI(唾液蛋白沉淀指数，saliva protein precipitation index)来评估红酒的涩味强度，其分析结果与感官审评结果较一致[6-7]。KUMIKO HARA等人证明绿茶中EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)具有明显沉淀唾液蛋白的作用，而所沉淀蛋白中主要含有α-唾液淀粉酶[8]。

目前，评价绿茶滋味品质特征主要采用感官审评方法，该方法更适合评价绿茶整体特征，但对于单一滋味的呈味强度并不能量化评价。在感官审评中，涩味容易受苦味和酸味影响，涩味的延续效应也会带来干扰，随着茶汤摄取浓度、摄取量、单位时间摄取次数的增加而增强[6]。另外，审评人员的身体状况、个人喜好，审评时茶汤的温度、pH、离子浓度等都会对审评结果产生影响。

本研究采用考马斯亮蓝法，通过测定绿茶茶汤与α-唾液淀粉酶的结合沉淀反应，探究评估绿茶茶汤涩味强度的可行性。研究结果为探究定量评估绿茶茶汤涩感，以及影响茶汤涩感的各呈味成分间的相互作用关系，提供了新思路。

1材料与方法

1.1材料

121个不同产地绿茶样品如表1所示。分别为湖北5个、四川5个、山东11个、陕西11个、广东3个、云南1个、安徽27个、浙江19个、江苏10个、湖南11个、贵州2个、广西2个、福建2个、河南3个、江西7个、日本2个。每个产地都按照不同等级、不同品类进行随机取样，1～36号样品进行了定量感官审评和考马斯亮蓝法测定。

1.2试剂与仪器

咖啡碱、EGC(表没食子儿茶素)、C(儿茶素)、EC(表儿茶素)、EGCG、ECG(表儿茶素没食子酸酯)、GA(没食子酸)等标准品，纯度均>99%，购于美国Sigma公司；色谱级纯乙腈、纯甲醇和纯乙酸，美国Tedia公司；氨基酸与茶氨酸的混合标样,氨基酸分析专用试剂AccQ.Tag(包括衍生化试剂AccQ.Fluor和磷酸缓冲盐)，购于美国Waters公司；改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购于生工生物工程(上海)有限公司；α-唾液淀粉酶，购于Cellbio 生物(上海)有限公司；实验所用的其他理化分析试剂均为分析纯；HPLC用水为屈臣氏蒸馏水。

表1　121个不同产地绿茶样品

HPLC系统：Waters 600高效液相色谱仪、600型的四元泵、荧光检测器(型号为2475)、紫外可见光检测器(型号2489)和Waters Empower色谱管理系统。HPLC氨基酸分析柱为美国Waters公司的AccQ.Tag C18氨基酸专用分析柱，HPLC色谱分析柱：Phenomenex Luna 5 μm, C18, 250 mm×4.6 mm Column；HPLC儿茶素色谱分析柱：Symmetry C18,5 μm,250 mm×4.6 mm Column.日本HITACHI公司的U-5100UV/VIS紫外分光光度计。

1.3实验方法

1.3.1主要化学成分含量测定

儿茶素及咖啡碱含量测定，参照GB/8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法》[9]；18种游离氨基酸含量测定参照Waters公司AccQ.Tag化学试剂包使用方法，色谱柱:AccQ.Tag C18氨基酸专用分析柱；干物质含量测定参照GB/T 8303—2013《茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》[10]。

1.3.2茶汤制备

按照GB/T 8302—2013《茶 取样》[11]，GB/T 8303—2013《茶 磨碎试样的制备及其干物质含量测定》[12]，称取磨碎后茶样3.00 g，加入150 mL沸水，浸提5 min，离心(3 500 r/min，10 min)，检测备用。

1.3.3定量感官审评分析

感官审评人员的训练和筛选参照SHU KANEKO等人的方法，最终选择安徽农业大学茶与食品科技学院四名评茶员进入最终审评小组。定量感官分析参照线性标度法[13](国际标准《BS ISO 4121:2003 Sensory analysis-Guidelines for the use of quantitative response scales》)和排序法[14](国际标准《BS ISO 16820:2004 Sensory analysis-Methodology Sequential analysis》)的方法原理，对涩味强度进行打分，不涩1分，微涩2分，较涩3分，涩4分，极涩5分。4位评茶员评分的平均值作为每个茶样涩味强度的最终值。

1.3.4α-唾液淀粉酶——Bradford法

按照生工公司改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒方法建立BSA标准曲线；准确称量100 mg人源α-唾液淀粉酶溶解于10 mL 37 ℃ ddH2O，离心(3 500 r/min，5 min)，取上清液作为α-唾液淀粉酶母液。

制样：分别取300 μL α-唾液淀粉酶母液和100 μL样品茶汤于1.5 mL离心管，记作C0；300 μL α-唾液淀粉酶母液和100 μL ddH2O,记作C1，100 μL样品茶汤和300 μL ddH2O,记作C2。快速涡旋2～3 s，于37 ℃水浴20 min,反应后将混合物离心(10 000 r/min，10 min)取上清液。

染色：取混合物上清液100 μL，加入1 mL Bradford试剂，迅速混匀。混匀后，室温静置10 min，期间颠倒混匀2～3次。

测定：595 nm条件下，测定各样品吸光值。根据标准曲线计算出蛋白浓度。C0值表示酚类物质与α-唾液淀粉酶结合反应后茶汤的蛋白含量水平，C1值表示原α-唾液淀粉酶的蛋白含量水平，C2值表示原茶汤的蛋白水平，则(C1+C2-C0)即为100 μL样品茶汤沉淀出的唾液淀粉酶的蛋白含量。每组样品需同时测定，从而消除茶汤中原可溶性蛋白含量的干扰，同时降低酚类物质与考马斯亮蓝染液反应所带来的影响。最终，以沉淀出的唾液淀粉酶蛋白含量与原唾液淀粉酶的蛋白含量比值作为SAPI(唾液淀粉酶沉淀指数，saliva amylase precipitation index)，即

SAPI=(C1+C2-C0)/C1

(1)

SAPI值越高，表示该样品对α-唾液淀粉酶沉淀能力越强。

1.4分析统计方法

数据基本分析在Excel中完成，主成分分析、因子分析及相关性分析等采用SPSS 17.0软件进行运算，图形绘制由Origin Pro8完成。

2结果与分析

2.1茶叶中主要呈味成分含量

分别测定121个绿茶样品的儿茶素、咖啡碱和18种氨基酸含量，统计结果见表2、表3。EGCG是绿茶中主要的儿茶素类物质，茶氨酸是主要的氨基酸类物质，其中，EGCG和ECG被认为是主要的涩味成分，茶氨酸被认为是鲜味成分，可以缓解茶的苦涩味，增强甜味[15]，而高浓度的茶氨酸同时具有酸味。

表2　121个不同产地绿茶儿茶素与咖啡碱含量(占干物质含量/%)

表3　121个不同产地绿茶18种氨基酸含量(占干物质含量 mg/g)

2.2茶叶中主要呈味成分因子分析

对121个绿茶样品的儿茶素、咖啡碱和18种游离氨基酸含量进行主成分分析和因子分析，原始数据经过取样适应性测量统计量(Kaiser-Meyer-Olkin, KMO)及Bartlett’s检验后发现，KMO值为0.879，Bartlett’s球形检验值为4 566，自由度为300，达0.01极显著水平，表示适合进行因子分析[16]。

利用主成分分析进行因子提取，并以Varimax法进行因子转轴，提取主特征值大于1的5个因子，特征值分别为12.76、3.01、2.48、1.42、1.07，解释变异量分别为51.03%、12.05%、9.93%、5.68%、4.30%，累积的解释变异量达82.98%，这表示因子分析结果能较好地代表原始变量。转轴后因子负荷量分析结果如表4所示，选取每个因子中负荷值最大的1～3个变量(>0.5)进行统计，因子一解释“缬氨酸”、“异亮氨酸”、“苯丙氨酸”、均具有苦味，所以将因子一，F1，命名为“苦味”；因子二，F2，可解释“谷氨酸”、“茶氨酸”、“组氨酸”，其中“谷氨酸”、“茶氨酸”具有鲜味，“组氨酸”微苦，所以将因子二命名为“鲜味”；因子三，F3，可解释“EGCG”、“ECG”和“咖啡碱”，所以将因子三命名为“涩味”；因子四，F4，主要仅解释“没食子酸”，具有酸味，所以将因子四命名为酸味，因子五，F5，主要解释“C”、“EC”，具有柔和的涩感，所以定义为“爽”。因子分析结果很好地解释了绿茶茶汤以苦涩、鲜爽为主体口感的呈味特征，利用该分析方法，并结合更全面得绿茶茶汤非挥发性成分含量的测定，可以更好地挖掘出绿茶茶汤中具有代表性的呈味特征成分。最终得到每个茶样的5个因子得分，并进一步将各因子得分与定量感官审评得分和SAPI值进行皮尔逊相关性分析。

表4　主要化学成分旋转成分矩阵a

提取方法 :主成分。 旋转法 :具有 Kaiser 标准化的正交旋转法。a. 旋转在 6 次迭代后收敛。

2.3考马斯亮蓝法测定绿茶茶汤与α-唾液淀粉酶的结合沉淀结果

绿茶茶汤与α-唾液淀粉酶经结合反应后离心，在离心管底部，可清晰地观察到沉淀析出，如图1所示。而原茶汤和原α-唾液淀粉酶溶液几乎没有沉淀析出，试验现象说明绿茶茶汤确实有沉淀α-唾液淀粉酶的作用，其中EGCG被认为是主要的作用成分[8，17-18]。试验所用α-唾液淀粉酶饱和母液的蛋白含量在220～240 μg/mL，标准蛋白曲线R2=0.997 8，在茶汤∶酶液(体积比)=1∶3水平下，茶汤对α-唾液淀粉酶的沉淀率在0.22～0.78之间，不同样品间差异较大，如图2所示。不同绿茶样品对α-唾液淀粉酶的沉淀能力不同。在染色过程中，随染色时间的延长，所测样品的吸光值逐渐减少，这与考马斯亮蓝G-250染料分子之间，以及G-250与蛋白质复合物之间发生聚集反应有关，该改良型Bradford法蛋白浓度测定试剂盒能在一定程度上减少此类误差，但严格控制每一个样品的反应时间，有利于试验结果更加稳定可靠。

C1-原α-唾液淀粉酶溶液；C2-原茶汤溶液；C0-茶汤与α-唾液淀粉酶反应液图1　绿茶茶汤对唾液淀粉酶的沉淀作用示意图Fig.1　The precipitation of green tea infusion with saliva amylase

图2　36个不同绿茶样品的SAPIFig.2　The SAPI of 36 green tea samples in different production regions

2.4因子得分、SAPI和定量感官审评得分的皮尔逊相关性分析结果

对绿茶茶汤5个滋味因子得分、SAPI值与定量感官审评得分进行皮尔逊相关分析，结果如表5所示。SAPI值与鲜味因子得分呈显著负相关(P<0.05)；与涩味因子得分呈正相关，但相关性系数较小；与定量感官审评涩味得分未表现出显著相关性。定量感官审评涩味得分与EGCG含量呈极显著正相关(P<0.01),同时涩味因子得分与EGCG含量呈极显著正相关(P<0.01)，说明EGCG是影响涩味感官审评的重要因素。茶氨酸含量分别与苦味因子得分、鲜味因子得分呈极显著正相关(P<0.01),与涩味因子呈极显著负相关(P<0.01)，与酸味因子呈显著正相关(P<0.05)，这可能说明茶氨酸在绿茶茶汤滋味构建中担当了多重角色，需要进一步试验证明。EGCG与酸味得分因子呈显著负相关，而酸味因子主要解释的是“GA”没食子酸的含量，推测这可能与绿茶加工过程中EGCG的水解反应有关，同时EGCG与GA在呈味特征方面可能存在相互作用关系。

表5　SAPI，因子得分和定量感官审评涩味得分的皮尔逊相关性分析

*. 在 0.05 水平(双侧)上显著相关；**. 在 0.01 水平(双侧)上显著相关。

3结论和讨论

5个表征绿茶滋味特征的复合因子，能解释绿茶“苦涩、鲜爽”为主的呈味特点。同时，如果对绿茶样品进行更全面的非挥发性成分测定，则有可能得到更具有代表性的滋味特征成分，该方法同样适用于探究其他茶类的滋味特征因子。

通过设计双空白对照(原α-唾液淀粉酶空白组和原茶汤空白组)，和严格控制每一个样品的反应时间及反应剂量，可以减少茶汤本身可溶性蛋白和茶汤中酚类物质与考马斯亮蓝染料分子间结合反应所带来的干扰，从而提高试验结果的准确性。但目前市售人源α-唾液淀粉酶标品纯度低、活性小，这给试验结果带来不可避免的误差。利用考马斯亮蓝法测定绿茶茶汤与α-唾液淀粉酶的沉淀结合反应，其反应条件和反应参数都需要更加系统的研究，该方法也同样适用于探究其他茶类对α-唾液淀粉酶的沉淀能力，从而进一步探究其与滋味的关系。

通过皮尔逊分析，定量感官审评涩味得分和SAPI值未表现出显著相关性，说明SAPI法不能够完全取代感官审评来评估绿茶的涩味强度，感官审评中涩味强度的感知受口腔内酚类物质及其他呈味成分的共同影响，所以感官审评涩味得分与EGCG含量表现出显著相关而与涩味因子得分未表现出显著相关。SAPI法所表征的绿茶茶汤沉淀α-唾液淀粉酶的能力可能只与酚类物质的含量有关，而无法捕捉其他成分对涩味的影响，但有关绿茶茶汤中能够沉淀α-唾液淀粉酶的化学成分还需要对反应后的上清液以及沉淀物进行细致分析才能确定，同时茶汤中可能存在着其他成分影响多酚类物质与α-唾液淀粉酶的结合反应。

本试验是为了实现定量评估绿茶茶汤涩味强度而研究采用的一种新方法，虽然利用该方法表征出不同绿茶对α-唾液淀粉酶的沉淀能力，但是沉淀能力与定量感官涩味审评和茶汤涩味因子得分间均未表现出显著相关性。据此，我们推测绿茶茶汤涩味的产生不仅与口腔中唾液蛋白的沉淀有关，可能还存在其它产生途径。此外，利用SDS-PAGE法测定茶汤与唾液蛋白的结合沉淀反应来评估绿茶茶汤的涩味强度可能更具有实践价值，有待于进一步探究。

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Study on the quantitative evaluation of green tea astringency intensity using Bradford method

SONG Ya-sai, NING Jing-ming, ZHANG Zheng-zhu, DING Ding,FANG Jun-ting, WAN Xiao-chun*

(State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization,College of Food Science and Technology， Anhui Agricultural University，Hefei 230036,China)

ABSTRACTNo method is available in evaluating the bitterness and astringency of green tea. Factors analysis was used to study the main chemical components in 121 green teas. Five main factors F1: bitterness, F2:umami, F3:astringency, F4:sourness and F5:refreshing were obtained, which could explain the feature of green tea taste. There are 36 samples which were measured by quantitative sensory evaluation and Bradford method, the result showed that the SAPI (saliva amylase precipitation index) and umami factor scores had significant negative correlation (P<0.05), quantitative sensory scores and EGCG had significant correlation(P<0.01); However, the correlation of SAPI, quantitative sensory scores and astringency factor scores was below the significant level. This indicated other possible influencing factors besides polyphenols precipitate saliva protein may need to be considered. This research can be used as a reference for the further study of the mechanism of astringency in green tea.

Key wordsgreen tea;astringency intensity;quantitative evaluation;Bradford method；SAPI

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201606025

基金项目：国家现代农业(茶叶)产业体系建设专项(CARS-23)；国家质量检验检疫总局公益性项目(201410225)

收稿日期：2015-10-07，改回日期：2015-11-18

第一作者：硕士研究生(宛晓春教授为通讯作者,E-mail：xcwan@ahau.edu.cn)。