吸附法发酵生产D-核糖固定细胞的条件研究

何姗，王朝臣，王树卿

（天津渤海职业技术学院，天津300402）



吸附法发酵生产D-核糖固定细胞的条件研究

何姗，王朝臣，王树卿

（天津渤海职业技术学院，天津300402）

摘要：经优化筛选，选择聚氨酯泡沫（HP）为载体，在pH值为7.0，温度36℃，转速240 r/min因素下，研究优化了吸附法一级种子固定化的培养条件，结论是40 mL培养基装0.3 g载体（约为30片HP片）培养14 h。在此基础上对二级种子固定化的培养时间进行了优化，结论是5 h，相比一级固定化，二级固定化性能明显增加。

关键词：D-核糖；吸附法；种子固定化；

D-核糖是一种具有重要生理功能的五碳糖，在食品和医药等领域有广泛的用途［1］。D-核糖最主要的生产方法是微生物发酵法。固定化技术是将细胞或酶限制在一定空间范围内并连续使用的一种方法，固定化细胞不但可以提高生产效率，延长细胞寿命，增加生产能力而且在生产后期易于细胞的分离、回收［2］。目前固定化细胞的方法主要有包埋法［3］和吸附法［4］。其中吸附法相比包埋法操作简单、相比游离发酵D-核糖产量高和载体廉价等优点［5］。吸附法固定细胞主要是在种子培养阶段进行固定，因此，本文主要对种子培养阶段的条件进行了探索，以期达到提高发酵产量、缩短发酵周期。

1　材料和方法

1.1实验材料

1.1.1菌种

D-核糖生产菌株－转酮酶缺陷型枯草芽孢杆菌。

1.1.2培养基

斜面培养基（g/L）：酵母浸膏7.0，蛋白胨15.0，山梨醇5.0，氯化钠2.0，磷酸氢二钾2.0磷酸二氢钾1.0，琼脂26，调pH值7.0。

种子培养基（g/L）：酵母浸膏5.0，磷酸氢二钾3.0，磷酸二氢钾1.0，葡萄糖20.0，调pH值7.0。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖150.0，硫酸铵7.0，硫酸锰0.05，玉米浆20.0。加碳酸钙15.0。

1.2实验方法

1.2.1培养条件

斜面培养：接菌种于斜面培养基36℃培养24 h。

种子培养：接一环菌于装有40 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，旋转式摇床240 r/min，36℃培养。

发酵培养：以15片聚氨酯泡沫（HP）接入装有30 mL培养基的500 mL三角瓶中，旋转式摇床240 r/ min，36℃培养。

1.2.2分析测定方法

菌丝体干重测定：菌丝体于80℃烘干至恒重后称量。

2　结果与讨论

固定化细胞应具有稳定的网状结构，所以在一定的pH值和温度下，不会被破坏［3］；虽然提高转速有助于发酵生产［6］，但是摇床转速有限，只能通过装液量的优化来约束溶氧水平和蒸发量，进而弥补转速不足。所以实验选定pH值为7.0，温度36℃，240 r/min进行其他因素试验研究。

2.1载体的选择

作吸附固定化的载体很多，其共同点是空隙率高。虽然多孔玻璃、海绵片、陶瓷片、小砖片、木屑、硅藻土、多孔硅和焦炭都是易得的载体，但是不同的载体对不同的菌种固定化性能是不同的。本文选取木屑、小砖片、聚氨酯泡沫（HP）做了对比试验，其中HP片的空隙率可达90%以上。由于砖片密度较大经过摇瓶培养在瓶底磨损太多，对固定化细胞的表征影响很大，所以选择放弃。以下是HP和木屑的实验数据见表1。

试验结果表明，以上两种载体都能吸附细胞，而且都能生产目的产物，证明吸附法固定可行。但木屑固定化中游离细胞和固定化的细胞总和较HP中的小很多，表明木屑对这种菌的生长可能有副作用。而HP空隙率的固定化效率和固定化能力都是较大的，而且HP常见、廉价，所以最终确定HP为吸附固定化载体。

表1　不同载体比较

2.2一级种子固定化

2.2.1一级种子固定化时间的确定

赵艳丽等［5］固定化时间一般是12 h，本实验选择从10 h开始计数以“载体吸附细胞干重/载体干重”为表征［7，8］，以大口三角瓶每瓶装载体0.202 g种子液40 mL进行种子培养。实验数据见图1。

图1　一级种子固定化时间曲线

图1表明随着时间的延长，固定化效果增强，14 h后固定化效果开始降低，虽然到了16 h，固定化效果再次出现增强趋势，考虑到时间、效率，本试验最终确定固定化时间是14 h。

2.2.2一级种子固定化载体量优化

种子固定化阶段载体的多少可能会影响菌体的生长或影响固定化效果，综合考虑多方面因素，载体量与装液量应该有一个适合的比例，对此作了实验，结果见图2。

图2　载体量影响图

图2表明载体量对载体的固定性能有一定的影响，载体量增大固定性能下降明显；而载体量的增加总的固定细胞数也会增加，综合考虑以上两点，从图中可以看出选择0.3 g载体为宜，这样既可有较好的固定化性能又可以兼顾到总的固定细胞量。本试验最终确定固定化载体量为“0.3 g载体/40 mL种子液”。

2.2.3种子固定化装液量确定

最初，根据以前做的游离细胞实验装液量数据选择了40mL，在此将保持载体量与装液量的比不变对装液量的时间曲线进行平行扩大实验，实验数据见图3。

图3　不同装液量时间曲线

图3表明40 mL的装液量较为合适。最后决定一级固定化用40 mL培养基，0.3 g载体，培养14 h。

2.3二级种子固定化

由于是摇瓶培养，在一级培养转二级培养时染菌几率大，所以其他条件不宜进行优化，本实验是以一级固定化的装液量和载体量不变只确定二级种子固定化时间，实验结果见图4。

图4　二级种子培养时间曲线

图4可见在二级种子培养初期载体固定性能有所下降，这应该是载体与培养基之间存在细胞量的平衡导致的。二级固定化时间较短而且后期固定化效果下降，这应该是因为自以及固定化后载体已经吸附了大量细胞，到二级固定化的后期营养不足菌种自溶造成的。为此对后期的种子剩余液做了镜检，观察有大量细胞自溶，但此不能说明载体内部的细胞生长状况，所以这一现象还需其他方法检测。

由于生产D-核糖所用的枯草芽孢杆菌在种子阶段成链状生长，选择二级种子固定可以延长种子在载体空隙中的生长时间，使菌体生长的更加长而粗壮数量更多，从而使空隙与菌体之间固定更加牢固，对固定化效果会有所加强。该实验数据表明二级固定化较一级固定化固定化性能明显增加。

3　结论

3.1本文首先对吸附载体进行了选择，选择几种常见廉价的载体中做实验，确定用HP做载体，吸附固定化枯草芽孢杆菌。

3.2文章对一级种子固定化进行了研究，优化了时间、装液量、载体量等重要参数。结果显示以40 mL培养基装0.3 g载体（约为30片HP片）培养14效果最好。

3.3二级种子固定化在一级种子固定化参数基础上只对培养时间进行了优化。结果显示二级种子固定化培养时间以5 h为益。结果还表明在固定化后期存在菌体自溶现象。

参考文献：

［1］Zimmer H G．The oxidative pentose phosphate pathway in the heart regulation［J］．physiological significance，and clinical impli⁃cation．Basic Research in Cardiology，1992，87（4）：303—316.

［2］成庆利，滑冰．固定化细胞研究进展［J］.河南教育学院学报：自然科学版，2003，12（2）：53-54.

［3］肖美艳，陈志文，等.包埋法固定化细胞技术研究进展［J］.生物工程进展，2003，24（4）∶158-160.

［4］邓晓泉.吸附法固定微生物细胞研究进展［J］.生物工程进展，1993，13（4）∶6-8.

［5］赵艳丽，胡斌，等.固定化发酵生产D-核糖工艺研究［J］.食品研究与开发，2008，29（9）∶97-100.

［6］彭彦峰.发酵法生产D-核糖参数分析方法和发酵工艺研究［D］.河北工业大学，2003.

［7］生物合成药物学［M］.北京：化学工业出版社，2000.

［8］张志平.中国新抗生素研究进展［J］.中国抗生素杂志，1998，23 （2）∶81.

Study on fermentation of d-ribose by immobilized cells through adsorption method

HE Shan，WANG Chao-chen，WANG Shu-qing
（Tianjin Bohai Vocational Technical College，Tianjin 300402）

Abstract:Choosing polyurethane foam（HP）as the carrier after optimal screening，studying and optimizing the culture conditions of adsorption method D-ribose level one seeds immobilization，in the factors that pH value of 7.0，temperature 36℃，the rotation rate of shaking table 240 r/min.The result is 40 ml culture medium，installed 0.3 g carrier（about 30 piece of HP piece）and cultured 14 h.Based on this，optimized the culture time of level two seeds immobilization，the conclusion is 5 h，compared with level one immobilization，level two immobilization obviously improves the features.

Key words：D-ribose；adsorption method；seeds immobilization conditions

doi：10.3969/j.issn.1008-1267.2016.01.010

中图分类号：TQ929

文献标志码：A

文章编号：1008-1267（2016）01-0028-04

收稿日期：2015-09-15