二甲双胍联合照射抑制人肺癌细胞的侵袭和转移的研究

王雯珺　列璞怡　郭敏章　何建行

(呼吸疾病国家重点实验室/广州医科大学附属第一医院　广东 广州　510120)



二甲双胍联合照射抑制人肺癌细胞的侵袭和转移的研究

王雯珺列璞怡郭敏章何建行

(呼吸疾病国家重点实验室/广州医科大学附属第一医院广东 广州510120)

【摘要】目的探讨二甲双胍联合照射对人肺癌细胞的侵袭和转移能力的影响，为研发肺癌有效的靶向治疗方案提供新思路。方法应用MTT法检测二甲双胍联合照射对肺癌肿瘤细胞的抑制作用，划痕和侵袭实验观察肿瘤细胞迁移和侵袭能力的改变，Western blot检测其侵袭转移相关因子MMP-2、MMP-9、VEGF的表达情况。结果MTT显示，不同浓度的二甲双胍对肺癌细胞A549具有显著的增殖抑制作用。二甲双胍组、照射组和联合处理组12 h和24 h的迁移距离均低于对照组。联合处理组作用于A549细胞的侵袭抑制作用也明显高于单用二甲双胍组和照射组。联合处理组可下调MMP-2、MMP-9和VEGF的表达。结论二甲双胍降低了肺癌肿瘤细胞的生长，下调了MMP-2、MMP-9、VEGF的表达，并有效抑制肺癌细胞的侵袭能力，提示二甲双胍在肺癌转移过程中起重要作用，可以作为肺癌的潜在治疗方案。

【关键词】二甲双胍；放疗；肺癌；侵袭；转移

肺癌是呼吸道最常见的恶性肿瘤之一，以放疗为基础的治疗有效地降低了肺癌患者的死亡率。但是由肺癌耐药引起的复发和转移仍然是进一步提高疗效的主要障碍。研究显示降糖药物二甲双胍可以显著降低合并2型糖尿病肺癌患者的发病率及死亡率，但是其具体机制尚未明确。本研究通过检测人肺癌细胞株A549经放疗联合或不联合二甲双胍处理后，细胞增殖、侵袭和转移的改变。初步探讨二甲双胍与放疗联合应用是否具有协同作用，能否提高放疗的抗瘤效应。

1材料与方法

1.1试验材料主要试剂：二甲双胍(sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司)，anti-MMP-2、anti-MMP-9、anti-VEGF抗体(santa cruz公司)，transwell板(康宁公司)，主要仪器：ECO2150型二氧化碳细胞培养箱(new Brunswick scientific)，电泳仪(bio-rad公司)，全自动酶标仪ELX80ONB(美国BIOTEK公司)。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养A549细胞为本实验室自存，细胞培养于37 ℃，5%CO2、10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基中。

1.2.2MTT法测细胞生存能力将处于对数生长期的A549细胞胰酶消化后，按照3×104接种于96孔板，细胞贴壁后加以不同浓度的二甲双胍培养3 d，检测IC50，将细胞分为4组：①对照组：用不含药物的培养基培养；②照射组：用2 Gy照射细胞，剂量率为300 cGy/min；③二甲双胍组：用含有IC50二甲双胍的培养基培养细胞，每组设5个复孔。④联合处理组：用含有IC50二甲双胍的培养基培养细胞联合2 Gy进行照射，每组设5个复孔。每隔24 h换1次液，培养48 h后用快速翻转法倒掉原培养基，每孔加入无血清的RPMI-1640培养液200 μl及5 mg/ml的MTT 20 μl继续培养4 h，吸出液体，每孔加入DMSO 150 μl。室温孵育10 min。微振荡器振荡15 min，用SpectraMax M5酶联免疫检测仪(Molecular Deyices公司)在549 nm波长测吸光度值(OD值)，以仅含有150 μl DMSO的空白孔调零，检测二甲双胍联合照射对细胞生长的影响。

1.2.3Tanswell检测细胞侵袭能力细胞侵袭实验在transwell小室中进行，分组如上，所有器皿及试管均先预冷，并将matrigel胶预先置4 ℃融化，用无血清培养基将其1∶3稀释、混匀，75 μl/孔加至聚碳酸酯膜上，再将小室放在24孔培养板的孔内，整个操作在冰上及无菌条件下进行，37 ℃放置2 h，每孔再加50 μl含10 g/L BSA的无血清培养基，37 ℃放置2 h，备用。3组细胞每组设3个复孔，在下室加条件培养液200 μl/孔，于37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，弃去上室中的培养液，将小室浸泡于95%乙醇中固定15 min，冲洗两遍后将小室在吉姆萨染液中染色15 min，并用生理盐水棉签轻擦去上室的胶，然后将膜切下，脱水、透明后，固定于载玻片上，在倒置显微镜下观察迁移到膜下的细胞数。计数方法：在400×视野下任取5个不重复视野，利用目镜测微尺计数每个视野穿透胶的细胞数目。

1.2.4划痕试验检测细胞的迁移运动能力细胞处理48 h后，将生长状态良好的细胞接种于6孔培养板中，待细胞长到完全融合时，用200 μl黄色枪头在6孔板的底面上沿直线轻轻进行划痕，PBS冲洗2次后继续培养，分别与8、16 h后在倒置显微镜下观察细胞划痕愈合情况并照相，以细胞划痕愈合百分比表示细胞的运动能力。

1.2.5Western blot检测侵袭转移相关因子的表达水平根据不同分组处理细胞48 h后，进行常规细胞裂解获取蛋白，4 ℃离心，取上清液，用BCA比色法测定蛋白浓度。取待测蛋白进行热变性处理，12%SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，然后脱脂奶粉进行封闭，加一抗4 ℃振荡过夜，辣根过氧化物酶标记二抗结合1 h，用ECL显色试剂盒显示目的条带，X胶片曝光。在图像分析仪上对胶片进行扫描及分析灰度值。

2结果

2.1二甲双胍对人肺癌细胞株A549生长的抑制作用使用不同浓度的二甲双胍作用于人肺癌细胞株A549，检测24、48、72 h后细胞存活率。MTT结果显示二甲双胍可以显著抑制A549细胞的增殖，且呈明显浓度及时间依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。计算得出48 h的IC50为12.52 mM，使用这一浓度检测二甲双胍联合照射对A549细胞增殖的影响，发现联合处理组的增殖率显著低于二甲双胍组和照射组。见表2。

表1　 二甲双胍对人肺癌细胞株A549

表2　不同处理组A549细胞的增殖情况±s)

2.2二甲双胍联合放疗对A549细胞迁移运动能力的影响细胞迁移是一种复杂的细胞生物学行为，细胞迁移的动态过程持续存在于肿瘤侵袭转移的始终。我们使用划痕实验检测二甲双胍联合放疗对A549细胞迁移的影响，见图1。二甲双胍组、照射组和联合处理组12 h和24 h的迁移距离均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

图1　二甲双胍联合放疗对A549细胞迁移运动能力的影响

分组0h12h24hFP对照组430.200±42.341405.232±13.452101.213±64.300二甲双胍组照射组411.230±31.233424.600±4.210387.012±11.210302.290±14.580162.240±52.100202.342±2.02362.1200.001联合处理组410.241±2.101367.983±31.200323.340±21.420

2.3二甲双胍联合放疗对细胞侵袭能力的影响Transwell实验中细胞侵袭穿过Matrigel的能力反映该细胞的侵袭能力，见图2。A549细胞的联合处理组的相对侵袭细胞数目明显少于二甲双胍组和照射组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表4。

图2　Transwell检测不同处理组对A549细胞侵袭能力的影响

A549分组n侵袭细胞数FP对照组3154.000±12.124二甲双胍组照射组33119.000±6.80693.333±8.81956.630<0.001联合处理组330.333±8.950

2.4蛋白印迹法检测侵袭相关因子的表达肿瘤的基本生长特点是侵润和转移，癌细胞对细胞外基质的降解和基底膜的穿透，及新生血管生成是侵润和转移的关键，金属蛋白酶家族(MMPs)是降解细胞外基质重要的蛋白酶，其中MMP-2和MMP-9是研究的最为广泛的两种金属蛋白酶，MMP-9可通过释放血管内皮生长因子(VEGF)以参与血管生成。在此实验中，使用Western blot实验检测侵袭相关因子MMP-2，MMP-9，VEGF的表达情况，表明联合处理组处理后MMP-2，MMP-9，VEGF的表达与二甲双胍组和照射组相比显著降低。见图3。

图3　Western blot检测侵袭相关蛋白

3讨论

二甲双胍是一种抗糖尿病药物，广泛被用于2型糖尿病的治疗，通过抑制肝糖原异生，增强肌肉葡萄糖摄取，抑制脂肪生成，减轻高血糖症。但是目前很多研究发现，二甲双胍可以减少肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等癌症的发生和发展[1-4]。也有学者进行了二甲双胍在结肠癌的病例系统回顾并进行了Meta分析，发现结肠癌患者使用二甲双胍进行干预处理，可明显改善其生存期[5]。在本研究中，我们证实二甲双胍抑制肺癌A549细胞的增殖，联合照射后可显著降低细胞的侵袭和迁移，同时Western blot检测发现二甲双胍可抑制侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF的表达。

二甲双胍可预防癌症的机理可能是降低内源性高胰岛素血症，提高外周组织对胰岛素的敏感性，目前已经明确内源性高胰岛素血症是心、脑血管病的重要危险因素，其高表达可以促进动脉粥样硬化，同时与肿瘤发病亦存在直接或间接的联系，有研究指出miR-133a的失调可引起多种类型的癌症，通过体内肿瘤生长的实验证明，miR-133a是卵巢癌中的重要调节剂，并且其抑制作用是通过靶向胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)介导的[6]，二甲双胍可以作用于IGF1R从而影响miR-133a的表达。另外，二甲双胍的降糖作用主要是通过激活AMPK信号通路实现的，研究发现癌细胞在低葡萄糖环境中存活是因为线粒体信号通路AMPK被抑制，AMPK是生物能量代谢调节的关键分子。AMPK可在各种代谢相关的器官中表达，能被机体各种刺激激活，包括细胞应激、运动和很多激素及能影响细胞代谢的物质。二甲双胍可以兴奋AMPK信号通路，激活相关蛋白激酶，抑制肿瘤细胞蛋白质的合成和细胞的生长和增殖[1，7]。最近有研究表明二甲双胍也可通过增加肿瘤CD8+浸润淋巴细胞(TILs)数量，阻止CD8+的TILs因为凋亡而减少，表现出抗癌效应[8]。

目前二甲双胍降糖作用是众所周知的，预防癌症的作用将是二甲双胍的又一重大发现。结合二甲双胍在肺癌组织上的研究，我们从理论上进一步证明了二甲双胍可以抑制肺癌的侵袭和转移，为二甲双胍的抗癌作用提供证据，联合二甲双胍治疗癌症可能是一种有效的治疗策略。

参考文献

[1]Gagnon J,Sheppard E,Anini Y.Metformin directly inhibits ghrelin secretion through AMP-activated protein kinase in rat primary gastric cells[J].Diabetes Obes Metab,2013,15(3):276-279.

[2]Li L,Han R,Xiao H,et al.Metformin sensitizes EGFR-TKI-resistant human lung cancer cells in vitro and in vivo through inhibition of IL-6 signaling and EMT reversal[J].Clin Cancer Res,2014,20(10):2714-2726.

[3]Ma J,Guo Y,Chen S,et al.Metformin enhances tamoxifen-mediated tumor growth inhibition in ER-positive breast carcinoma[J].BMC Cancer,2014,14(1):172.

[4]Makled A K,El S M,Elkabarity R.Assessment of ovarian stromal blood flow after metformin treatment in women with polycystic ovary syndrome[J].Arch Gynecol Obstet,2014,289(4):883-891.

[5]Nangia-Makker P,Yu Y,Vasudevan A,et al.Metformin: a potential therapeutic agent for recurrent colon cancer[J].PLoS One,2014,9(1):e84369.

[6]Guo J,Xia B,Meng F,et al.miR-133a suppresses ovarian cancer cell proliferation by directly targeting insulin-like growth factor 1 receptor[J].Tumour Biol,2014,35(2):1557-1564.

[7]He X X,Tu S M,Lee M H,et al.Thiazolidinediones and metformin associated with improved survival of diabetic prostate cancer patients[J]. Ann Oncol,2011,22(12):2640-2645.

[8]Eikawa S,Nishida M,Mizukami S,et al.Immune-mediated antitumor effect by type 2 diabetes drug,metformin[J].Proc Natl Acad Sci,2015,112(6):1809-1814.

Inhibition of lung cancer cells migration and invasion by metformin combined with irradiation

Wang Wenjun，Lie Puyi，Guo Minzhang，He Jianxing

(RespiratoryDiseaseStateandKeyLaboratory/TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510120,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of metformin combined with irradiate on migration and invasion capacity in lung cancer so as to shed new light on the development of target therapy for lung cancer. MethodsInhibitory effect of metformin combined with irradiation on A549 cells was detected by MTT. The migration and invasion capacity of tumor cells were assessed by wound healing assay and transwell chamber with matrigelgel, respectively. Expression of MMP-2, MMP-6, VEGF was measured by Western blot. ResultsMTT assay showed an obvious suppression of A549 cells proliferation in response to Metformin treatment. 12 h and 24 h migration distances in the metformin group, irradiation group and combined treatment group were lower than the control group. The combined treatment with metformin and Irradiation also caused a significantly higher inhibition rate of A549 cells invasion than metformin or Irradiate alone. The combined treatment group could down regulate the expression of VEGF, MMP-9 and MMP-2. ConclusionMetformin reduced the growth of lung cancer tumor cells, down regulated the expression of MMP-2, MMP-9 and VEGF, inhibited the lung cancer cell invasion. It suggests that metformin can play an important role in the metastasis of lung cancer and maybe a potential therapy for lung cancer.

【Key words】metformin; radiotherapy; lung cancer; migration; invasion

基金项目：国家自然科学基金(81301939)；博士后基金(2015M570697)。

通讯作者：何建行，E-mail：hejx@vip.163.com。

【中图分类号】R 734.2

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.05.003

(收稿日期：2015-09-22)