实验动物金黄色葡萄球菌的实验室检测能力验证结果评价

冯育芳，邢进，付瑞，王吉，李晓波，王淑菁，贺争鸣，岳秉飞*

（中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050）



实验动物金黄色葡萄球菌的实验室检测能力验证结果评价

冯育芳，邢进，付瑞，王吉，李晓波，王淑菁，贺争鸣，岳秉飞*

（中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所，北京 100050）

【摘要】目的 通过实施实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证计划，了解实验动物检测机构检验能力，提高实验动物质量检测水平。方法 按照CNAS批准的能力验证方案，通过低温冻干制备样品，经过稳定性和均匀性检验合格，作为能力验证样品。采用随机编号，发样给参加单位，并附作业指导书。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件，其结果与样品预检结果一致的判为满意结果，不一致或未能提交结果的判为不满意结果。结果共有28个实验室参加本次能力验证项目，其中获得满意验证结果的实验室为22个，占总参加机构的78.57%；未得到满意验证结果的实验室为6个，占21.43%。采用国标检测方法的有27个，采用PCR检测方法的有1个。结论 实验动物质量检测机构对金黄色葡萄球菌的检测能力较高，实施能力验证计划能够反映实验室的检测水平。

【关键词】实验动物；金黄色葡萄球菌；能力验证样品

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）属于葡萄球菌属（Staphylococcus），是人和动物体表、皮、毛、鼻、口腔、消化道的常见菌，也是一种条件致病菌。在大多数情况下，携带金黄色葡萄球菌的动物为健康动物，但当动物由于外伤、应激和环境造成免疫低下时，可引起化脓性睾丸炎、前列腺炎、卵巢脓肿、子宫内膜炎等，影响动物种群繁育和动物实验结果［1］。中华人民共和国国家标准GB14922.2-2011《实验动物微生物学等级及监测》将金黄色葡萄球菌列为SPF级大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠和兔必须排除的病原菌［2］。近5年来我室共检测SPF级实验动物6199只，其中，金黄色葡萄球菌阳性率为2.5%，是SPF级动物检测中最常见的污染菌。

实验室能力验证，是通过实验室间检测结果的比对来确定实验室能力的活动，是实验室证明其技术能力的一种主要手段。当前，能力验证是国际通行的实验室质量控制方法之一，已成为世界各国政府以及国际实验室认可组织广泛采用的重要技术手段［3］。为提高实验动物中金黄色葡萄球菌的检出能力，依据 CNAS-RL03《能力验证提供者认可准则》［4］进行本次检测能力验证工作（NIFDC-PT-011）。

本项目的研究，包括金黄色葡萄球菌能力验证样品的制备工作、制定合适的评价方案以及比对结果的汇总分析，探讨实验动物致病菌检测能力验证计划的组织和实施工作，为今后实验动物微生物检测能力验证计划的实施提供有价值的参考和借鉴作用。

1　材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

金黄色葡萄球菌为标准参考株CMCC26112，购自中国食品药品检定研究院中国医学菌种保藏中心；本次验证工作设置1个干扰菌-木糖葡萄球菌，该菌为日常检测中常见的葡萄球菌，菌株为本室分离株，均用梅里埃的Staphy生化条进行了鉴定。

1.1.2 试剂材料

冻干液由中国食品药品检定研究院食品化妆品检定所提供；培养基包括葡萄球菌培养基110、哥伦比亚血琼脂基础和高盐甘露醇培养基；生化鉴定试剂为梅里埃的葡萄球菌鉴定条。

1.1.3 SPF大鼠

在进行造林之后需要进行及时的验收，但是在实际的验收工作中存在一定的问题。第一，对需要验收的项目没有进行及时的自查验收，没有进行建档工作。第二，一些验收工作只是在表面上进行，没有真正落实到位。第三，验收图纸和实际的情况存在一定才差距。

SPF级SD大鼠5只，体重200～250 g，2月龄，由中国食品药品检定研究院提供【SCXK（京）2014-0013】。实验在中国食品药品检定研究院进行【SYXK（京）2011-0008】。

1.2 方法

1.2.1 质控样品制备

将36℃培养24 h的金黄色葡萄球菌和木糖葡萄球菌分别用无菌生理盐水调成1011CFU的菌悬液备用。将75%的冻干液和25%的SPF大鼠粪便（高压灭菌后）震荡混合制成混悬液，每个冻存管中分装180 μL的混悬液，然后加入20 μL金黄色葡萄球菌菌悬液作为单一阳性样品、加入20 μL金葡菌和20 μL木糖菌菌悬液作为混合阳性样品，加入20 μL冻干保护液作为阴性样品，用冷冻干燥机制成冻干样品。样品采用随机编号原则进行编号。

1.2.2 质控样品均匀性试验

随机抽取每种冻干质控样品20管，参照作业指导书，对样品进行检验。阳性质控样品应检出金黄色葡萄球菌，阴性质控样品不应检出金黄色葡萄球菌。

将金黄色葡萄球菌能力验证质控样品于-20℃、4℃、25℃、37℃保存。-20℃和4℃于0、1、2、3、4、5、6周，各抽取2个样品，25℃、37℃于0、1、3、5、7、14、28 d，各抽取2个样品，对质控样品进行检验。阳性样品只要能够检出金葡菌即为可用，而阴性样品不能检出金葡菌。同时对贮藏稳定性进行评价。

1.2.4 参加实验室

全国共28家实验室参加了此次能力验证计划。

1.2.5 检测方法

本次能力验证建议参考GB/T14926.14-2001实验动物金黄色葡萄球菌检测方法。但不规定具体测试方法，仅要求在结果报告单中注明所用的检测方法。

1.2.6 结果判定标准

阴性样品和标准阳性样品的检测结果与标准结果一致，即判定为满意结果。阴性样本检测结果或标准菌株阳性样本的检测结果与标准结果不一致，即判定为不满意结果［5］。

2　结果

2.1 质控样品均匀性试验结果

随机选取20瓶阳性、20瓶混合样品和20瓶阴性样品用于均匀性验证，所有样品以随机次序在重复性条件下分别对样品中的金黄色葡萄球菌进行检测。在20瓶阴性样品中均未检出目标菌，而在20阳性样品和20瓶混合样品中均检出目标菌，表明所制备的样品是均匀的。

2.2 质控样品稳定性试验结果

按照1.2.3的方法对所制备的质控品进行温度和运输稳定性试验，冷藏（4℃）存储 6周，常温（2℃）放置28 d或高温（37℃）放置14 d，阳性检测率均能达到100%。常温（25℃）或高温（37℃）运输7 d，阳性检测率也能达到100%，也证明了所制备质控品的稳定性达到发放要求。

2.3 实验室反馈结果及采用方法

参加此次比对共28个实验室，均在规定时间内给出了反馈结果；根据结果判定标准满意的实验室有22个，占实验室总数的79%，不满意的实验室有6个，占实验室总数的21%，这6家不满意实验室中，有4家将混合阳性样品检测为阴性，有1家将阴性样品检测为阳性，有1家将阳性样品检测为阴性。本次结果不公布具体实验室名称，仅以实验室编号进行统计，实验室编号从 NIFDC-PT-011-001～NIFDC-PT-011-028，具体结果见表1。

表1　实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证结果汇总Tab.1 Summaries of validation of the detection ability of Staphylococcus aureus in laboratory animals

3　讨论

从NIFDC-PT-011实验动物金黄色葡萄球菌检出能力验证计划结果报告中可以看出，本次能力验证计划共计有28家实验室参加，所有实验室均在规定时间内提交了结果反馈单。其中满意结果的22家，占79%，不满意结果有6家，占21%，27家实验室均参照了国标中的方法进行检测，只有1家实验室采用的是PCR方法进行检测。6家不满意实验室中有4家将混合阳性样品判定为阴性，一方面说明样品因为掺杂了木糖葡萄球菌对金黄色葡萄球菌的检测有一定的影响，致使在分离培养时出现了漏检金葡菌的现象，另一方面也说明在参加比对计划时应尽可能采用2种以上的培养基对样品进行检测，以免造成漏检，出现对结果的判断不正确。必要时可实行2人同时检测，避免出现主观判断错误。

能力验证是实验室检测质量监控的重要手段，既是实验室内部质量控制的补充，又是政府和社会了解实验室检测能力的重要方法［9］。能力验证作为日常监督检查的辅助手段，能够有效提升实验室的检测能力。促进实验室保持有效的检测能力，同时也帮助部分实验室及时发现自身的不足并加以改进，为更好地检测实验动物提供有力的技术支撑［5-8］。

参考文献

［1］ 方喜业，邢瑞昌，贺争鸣.实验动物质量控制［M］.北京，中国标准出版社，008：371-372.

［2］ GB/T14922.2-2011，实验动物微生物学等级及监测［S］.中国标准出版社，2011.

［3］ CNAS-RL02，能力验证规则［S］.中国合格评定国家认可委员会，2010.

［4］ CNAS-RL03，能力验证提供者认可准则［S］.中国合格评定国家认可委员会，2010.

［5］ 邢进，冯育芳，王洪，等.实验动物中绿脓杆菌检测能力验证的结果与分析［J］.中国药事，2014，28（9）：982-989.

［6］ 王洪，魏杰，李芳芳，等.实验动物质检机构碱性磷酸酶-1测定能力验证评价［J］.中国药事，2014，28（12）：1339-1341.

［7］ 李晓波，王洪，付瑞，等.实验大鼠细小病毒H-1株抗体检测能力验证结果评价［J］.中国药事，2014，28（9）：990-994.

［8］ 魏杰，王洪，李芳芳，等.实验室能力验证用酯酶-3标准样品的均匀性和稳定性研究［J］.中国药事，2014，28（9）：990-994.

［9］ 陈文胜，罗建波，刘礼平.实验室质量监督工作探讨［J］.华南预防医学，2007，33（增刊）：105-107.

Evaluation of the ability to detect Staphylococcus aureus in experimental animal laboratories

FENG Yu-fang，XING Jin，FU Rui，WANG Ji，LI Xi-bo，WANG Shu-jing，HE Zheng-ming，YUE Bing-fei*
（Institute for Laboratory Animal Resources，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective To verify the detection ability of experimental animal quality detection laboratories in China for Staphylococcus aureus.Methods The testing samples for Staphylococcus aureus detection were prepared by bacterial culture，homogeneity test and stability test，according to the study plan approved by CNAS.Then the samples and operation instruction were sent to the participant laboratories.The detection reports from these laboratories should be submitted before the deadline expires，and the collected data were summarized and analyzed.Results There were 28 laboratories which joined to this test plan.Among them 22 laboratories（78.57%）achieved satisfactory test results，and six laboratories （21.43%）had unsatisfactory test results.27 Laboratories used the national standard detection assay，while only one laboratory used PCR assay.Conclusions Most of experimental animal quality testing laboratories in China have sufficient proficiency in detection of Staphylococcus aureus.The obtained information are very helpful for the laboratory ability verification testing in future.

【Key words】Laboratory animals；Staphylococcus aureus；Detection ability validation

【中图分类号】Q95-33

【文献标识码】A

【文章编号】1005-4847（2016）02-0195-04

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.016

［基金项目］国家科技支撑计划（编号：2015BAI09B00）。

［作者简介］冯育芳（1981-），女，副研究员，研究方向：实验动物微生物检测。E-mail：fyf307@126.com

［通讯作者］岳秉飞（1960-），男，研究员，研究方向：实验动物学。E-mail：y6784@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13