宁夏自育水稻品种及部分引进品种的稻瘟病抗性基因分子标记检测

张银霞，田　蕾，李培富

(宁夏大学 农学院， 银川　750021)

宁夏自育水稻品种及部分引进品种的稻瘟病抗性基因分子标记检测

张银霞，田蕾，李培富

(宁夏大学 农学院， 银川750021)

为明确宁夏水稻种质资源中含有的抗稻瘟病基因型及基因数量，为水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择育种奠定基础。采用与抗稻瘟病基因Pita、Pi-kh、Pib、Pi2、Pi-km、Pi9、Pi5紧密连锁的7个分子标记，对25份宁夏自育水稻品种和55份引进水稻品种的抗稻瘟病基因进行分子检测。结果表明，宁夏自育水稻品种的抗稻瘟病基因较少，68%的材料仅含1～2个抗瘟基因，缺乏Pita、Pi2基因；抗病性鉴定也证实，只有8份材料达到中等抗性，主要含有Pib、Pi-km、Pi9抗瘟基因。37%的引进品种含3～6个抗稻瘟病基因，主要抗瘟基因有Pib、Pi-kh、Pi-km、Pi2、Pi9和Pita，这些材料均可为宁夏水稻抗稻瘟病的分子标记辅助选择育种提供抗病基因。

水稻；种质资源；抗稻瘟病基因；分子检测

水稻(Oryzasativa)是世界上最重要的粮食作物之一。由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；无性态：Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病是影响水稻生产的主要病害之一[1]，严重威胁世界粮食安全[2-3]。实践证明，利用抗稻瘟病基因培育抗性品种是防治水稻稻瘟病最经济、有效、环保的手段[3-4]。

宁夏是中国北方粳稻主产区之一，近年来，随着全球气候变暖，稻瘟病的发生越来越严重，已成为宁夏水稻的常发性病害，每年都有不同程度的发生，主要以叶瘟和穗颈瘟危害为主，尤其是2006-2007年，局部地区甚至大发生，严重制约宁夏灌区水稻增产[5]。宁夏的水稻栽培历史悠久，富有独特的水稻遗传资源，但这些种质资源却未得到充分利用，其原因之一是这些种质资源的抗稻瘟病基因类型和抗性尚不清楚；其次是由于目前多采用常规方法育种，而该方法通常在抗病性是由主效基因控制时才最有效，并且效率低、工作量大、操作困难。

近年来发展起来的分子标记技术可快速、准确鉴定出材料中所含的抗性基因类型，并利用与稻瘟病抗性基因紧密连锁的分子标记进行辅助选择，这对于培育抗稻瘟病水稻品种有重要意义。目前，已定位的抗稻瘟病基因至少有68个位点，共83个主效基因，它们成簇分布于除第3染色体外的所有水稻染色体[6]。已有叶瘟、颈瘟、苗瘟等的24个抗稻瘟病基因被克隆(国家水稻数据中心http://www.ricedata.cn/)，与其紧密连锁或共分离的分子标记大多都已被开发。因此，本研究利用与抗稻瘟病基因Pita、Pi-kh、Pib、Pi2、Pi-km、Pi9和Pi5紧密连锁的7个分子标记，对宁夏水稻种质资源的抗病基因进行分子检测与分析，旨在查明这7个抗性基因在宁夏水稻种质资源中的分布情况，为宁夏水稻抗病性的分子标记辅助选择育种提供参考。

1材料与方法

1.1供试材料

宁夏自育水稻品种25份，由宁夏大学、宁夏农科院选育；宁夏引进水稻品种55份。具体品种名称见表1。

表1　供试材料

1.2方法

1.2.1引物合成PCR特异性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司合成，序列见表2。

1.2.2基因组总DNA提取采用SDS法提取总DNA，并用琼脂糖电泳检测DNA质量浓度。以总DNA为模板进行PCR扩增，20 μL反应体系：10×Buffer(含Mg2+)2.0 μL，2.5 mol/mL dNTP 0.4 μL，每种引物(2 mmol/L)各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，模板DNA 2.0 μL，最后用ddH2O补足20 μL。PCR反应程序：94 ℃，5 min；然后35个循环：94 ℃，45 s，退火温度依据引物说明而定，72 ℃，1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳，核酸染料染色，紫外灯下观察拍照。

表2　用于PCR反应的引物名称、序列及预期片段大小

2结果与分析

2.1宁夏自育水稻品种抗稻瘟病基因分子检测结果

对宁夏自育水稻品种抗稻瘟病基因进行分子检测，结果(表3)表明，这些品种含抗稻瘟病基因相对较少，其中，含5个抗稻瘟病基因的品种1个(SD-1)，占供试品种总数的0.4%，经大田抗稻瘟病试验鉴定为中抗[14]；含4个抗稻瘟病基因的品种4个，占供试品种总数的16%，经大田抗稻瘟病试验鉴定为中抗[14]；含3个抗稻瘟病基因的品种5个，占供试品种总数的20%，经大田抗稻瘟病试验鉴定为中抗[14]；其他品种含1～2个抗稻瘟病基因，占供试品种总数的68%，经大田抗稻瘟病试验鉴定为感病[14]。

25个品种中，含Pita基因的品种5个，占供试品种总数的20%，主要分布于各抗病品种；含Pi-kh基因的品种7个，占供试品种总数的28%，也主要分布于各抗病品种；含Pib基因的品种13个，占供试品种总数的52%，在感病品种和抗病品种中均有分布；含Pi-km基因的品种11个，占供试品种总数的44%；含Pi9基因的品种9个，占供试品种总数的35%；含Pi2基因的品种6个，占供试品种总数的24%；含Pi5基因的品种10个，占供试品种总数的40%，主要分布于各感病品种。以上结果表明，宁夏自育水稻品种花‘118’‘花119’‘SD-1’‘SD-2’‘2007XZ-181’‘节11’等均为中等抗病品种，且含有的抗稻瘟病基因主要是Pi-kh、Pib、Pi-km和Pi9，而在感病品种中主要含有Pi5(表3、图1～图5)。

表3　宁夏自育水稻品种抗稻瘟病基因的分子检测结果

注：+. 携带抗性基因；-.不携带抗性基因；MR. 中抗；S. 感病。下同。

Note: +. Carrying resistance gene; -. No carrying resistance gene; MR. Middle resistant; S. Susceptible. The same below.

2.2引进水稻品种抗瘟病基因分子检测结果

对引进水稻品种抗稻瘟病基因进行分子检测，结果表明，这些品种含有的抗稻瘟病基因数明显高于宁夏当地品种，其中，有9个品种，如‘香粳2号’‘圣香粳2572’‘降糖稻’‘吉粳108’‘通系929’等，含4～6个抗稻瘟病基因；有11个品种含3个抗稻瘟病基因；其他品种含1～2个抗稻瘟病基因(表4和图2)。

55份材料的抗稻瘟病基因分布见图1，结果显示，56%的品种含抗稻瘟病基因Pib，43.6%的品种含抗稻瘟病基因Pi-km，36%的品种含Pi9基因，32.7%的含Pita基因，25.5%的品种含Pi-kh基因，23.6%的品种含Pi5基因，9%的品种含Pi2基因。即Pib、Pi-km、Pi9和Pita是宁夏引进品种含有的主要抗稻瘟病基因。

图1　7个抗稻瘟病基因在55份引进材料中的分布

序号Number品种名称VarietyPitaPi-khPibPi-kmPi9Pi2Pi5总数Total1大胚稻 Largeembryorice--++--+32巨胚稻 Giantembryorice--+----13耐贮藏 Storagerice+-+----24银玉 Silverjade------+15圣稻13 Shengrice13----+--16圣稻14 Shengrice14--+---+27圣稻15 Shengrice15----+--18圣稻16 Shengrice16--+---+29圣稻17(516) Shengrice17(516)----+-+210临稻11 Linrice11--+-+-+311香粳9407 Xiangjing9407--+-+-+312圣香粳2572 Shengxiangjing2572+++++--513绿米 Greenrice---+---114小粒糯 Smallwaxy---+---115降糖稻 Hypoglycemicrice+++-+--416秋田小町 Akitakomachi--++--+317大粒稻 Largegrainrice---++--218高粱稻-1 Sorghumrice-1------+119高粱稻-2 Sorghumrice-2--+-+--220奥326 Ao326---+---121吉粳44 Jijing44--+-+--222LDC355-------023L0307S++-+---324吉2000F59 Ji2000F59--+----125优育41 Youyu41+--+---226吉粳108 Jijing108++-++--427盐丰47 Yanfeng47+--+---228盐粳218 Yanjing218++-+---329吉大6号 JidaNo.6--+--+-230香粳2号 XiangjingNo.2++++++-631松辽5号 SongliaoNo.5+++----332松辽6号 SongliaoNo.6----+--133松辽7号 SongliaoNo.7---+---134春香糯1号 SweetglutinousriceNo.1---++--235Z-22++-++--436沈稻121 Shenrice121----+-+237法国稻 Frenchrice--+-+-+338日本晴 Nipponbare--+----139Agostone--++---240富源4号 FuyuanNo.4--+----141吉粳105Jijing105+++----342吉粳106Jijing106+++----343龙粳21Longjing21---+---144龙粳31Longjing31++-+-+-445龙粳36Longjing36--+--+-246春优1号 ChunyouNo.1++++---447松辽08-27 Songliao08-27+-+----248通98-56 Tong98-56----+-+249通系929 Tongxi929++---++450通粘1号 TongnianNo.1--+----151通院835 Tongyuan835+++-+--452空育131 Kongyu131--+++--353J-206--++---254Bertone--++---255越光 Koshihikari--++---2

第1行First line：1. 大胚稻Large embryo rice；2. 巨胚稻Giant embryo rice；3. 耐贮藏Storage rice；4. 银玉Silver jade；5.未扩增出条带 No amplification bands； 6. 圣稻13 Sheng rice 13；7. 圣稻14 Sheng rice 14；8. 圣稻15 Sheng rice 15；9. 圣稻16 Sheng rice 16；10. 圣稻17 Sheng rice 17；11 .临稻11 Lin rice 11；12. 香粳9407 Xiangjing 9407；13. 圣香粳2572 Shengxiangjing 2572；14. 绿米Green rice；15. 小粒糯Small waxy；16. 降糖稻Hypoglycemic rice；17. 秋田小町Akitakomachi；18. 大粒稻Large grain rice；19. 高粱稻-1 Sorghum rice-1；20. 高粱稻-2 Sorghum rice-2；21. 奥326 Ao 326；22. 吉粳44 Jijing 44；23. LDC355；24. L0307S；下同 The same below

第2行Second line：1. 宁粳16 号Ningjing No.16；2. 吉2000F59 Ji 2000F59；3. 宁粳36号Ningjing No.36；4.宁粳43号Ningjing No.43；5. 优育41 Youyu 41；6.宁粳34号Ningjing No.34；7. 宁粳24号Ningjing No.24；8. 吉粳108 Jijing 108；9. 盐丰47 Yanfeng 47；10. 盐粳218 Yanjing 218；11. 吉大6号Jida No.6；12. 香粳2号Xiangjing No.2；13. 松辽5号Songliao No.5；14. 松辽6号Songliao No.6；15. 松辽7号Songliao No.7；16. 春香糯1号Sweet glutinous rice No.1；17. Z-22；18. 花118 Hua 118；19. 花119 Hua 119；20. 节11 Jie 11；21. 2007G-318；22. 沈稻121 Shen rice 121；23. 2001QX-62；24.11NX-2417；下同 The same below

第3行Third line：1. SD-1；2. SD-2；3. 2007XZ-181；4. 法国稻French rice；5. 日本晴Nipponbare；6. Agostone；7. 富源4号Fuyuan No.4；8. 吉粳105 Jijing 105；9. 宁粳38号 Ningjing No.38；10.未扩增出条带 No amplification bands;11.未扩增出条带 No amplification bands；12. 宁粳40号Ningjing No.40；13.吉粳105 Jijing 106；14. 宁粳37号Ningjing No.37；15. 花94 Hua 94；16. 宁大95 Ningda 95；17. 宁粳27号Ningjing No.27；18. 2004D4；19. 宁粳41号Ningjing No.41；20. 宁粳33号Ningjing No.33；21. 龙粳21 Longjing 21；22. 龙粳31 Longjing 31；23. 龙粳36 Longjing 36；24. 春优1号Chunyou No.1；下同 The same below

第4行Fourth line：1. 未扩增出条带 No amplification bands；2.未扩增出条带 No amplification bands；3. 松辽08-27 Songliao 08-27；4. 通98-56 Tong 98-56；5. 通系929 Tongxi 929；6. 通粘1号Tongnian No.1；7. 通院835 Tongyuan 835；8. 空育131 Kongyu 131；9. J-206；10. Bertone；11. 越光Koshihikari；12.宁粳12号Ningjing No.12；13. 湼罗Nieluo；14. 杨和白皮稻Yanghe white rice；15. 未扩增出条带 No amplification bands；16.未扩增出条带 No amplification bands；17.未扩增出条带 No amplification bands；下同 The same below

图2部分水稻品种中抗性基因Pita的PCR扩增

Fig.2PCR amplification ofPitagene in part of rice variety

图3　部分水稻品种中抗性基因Pi2的PCR扩增

图4　部分水稻品种中抗性基因Pib的PCR扩增

图5　部分水稻品种中抗性基因Pi5的PCR扩增

3讨论与小结

由于稻瘟病菌生理小种高度易变，抗瘟品种通常在3～5 a后便丧失抗性[15]，将多个抗性基因聚合至一个品种是增加品种抗性和抗谱、培育多抗品种、避免或减缓水稻抗性丧失的有效途径。在聚合杂交中，应用目标性状紧密连锁的分子标记进行辅助选择，可快速、准确将多个目标基因聚合于一个重组体[16]。本研究采用7个抗稻瘟病基因紧密连锁的分子标记对宁夏自育水稻品种和部分引进水稻品种进行检测，结果表明，宁夏自育水稻品种含的抗稻瘟病基因数较少，抗性较差，抗病性最佳的品种仅为中等抗病；抗性材料主要含Pi-kh、Pib、Pi-km、Pi9等抗稻瘟病基因，说明宁夏自育水稻品种所含的抗稻瘟病基因Pi-kh、Pib、Pi-km、Pi9对宁夏本地的稻瘟病生理小种具有一定的抗性。而宁夏自育品种缺乏Pita和Pi2基因，而Pita基因是主效抗稻瘟病基因，在中国很多稻区均表现高水平的稻瘟病抗性[17]，若以此为主效基因，聚合其他抗性基因，可以提高水稻品种的持久抗稻瘟病能力。

引进的55份水稻品种含的抗稻瘟病基因数明显高于宁夏自育品种，部分品种含5～6个抗稻瘟病基因，且所含的主要抗稻瘟病基因是Pib、Pi-km、Pi9和Pita。这些材料可以为宁夏培育抗稻瘟病水稻品种提供优良抗性基因。王军等[18]研究表明，Pita、Pib抗稻瘟病基因与江苏省粳稻穗颈瘟的抗性呈正相关，Pita与Pib联合可显著提高江苏省粳稻穗颈瘟抗性。目前，穗颈瘟是宁夏地区为害最严重的稻瘟病害，因此，可利用含有Pita基因的引进品种与当地品种进行MASB育种，选育抗穗颈瘟的抗病品种。董巍等[19]通过MASB方法将供体BL6的 Pi1、 Pi2抗性基因聚合至培矮64S水稻品种，筛选出10株对稻瘟病的叶瘟和穗颈瘟抗性明显增强的改良株系。有研究表明，多个抗性基因聚合后，抗性基因间表现出极显著的基因互作，可协同抵抗单个抗病基因不能抵抗的生理小种[16]，这是多基因聚合后抗谱拓宽、抗性增强的重要原因。因此，基因聚合可作为培育稻瘟病持久抗性的有效方法。

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Detection and Analysis of Rice Blast Resistance Gene in Rice Varieties Bred in Ningxia and Introduced from Outside Ningxia

ZHANG Yinxia,TIAN Lei and LI Peifu

(School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan750021,China)

The blast resistant genotype and quantity of rice germplasm in Ningxia and from other places were detected and analyzed in order to lay the foundation for breeding rice for disease resistance by Molecular marker-assisted selection (MAS). 25 rice varieties bred in Ningxia and 55 introduced varieties were detected by using the molecular markers closely linked to the rice blast resistance genesPita,Pi-kh,Pib,Pi2,Pi-km,Pi9 andPi5. The results showed that 25 rice varieties bred in Ningxia contained resistant gene were less and 68% of them only contained 1-2 resistant gene and lackedPitaandPi2 genes. Resistance evaluation of them in the field also confirmed that resistant varieties were less (8 of them) and they could reach medium resistance to rice blast and mainly contained the resistant gene ofPib,Pi-kmandPi9. 37% of 55 introduced rice varieties contained 3-6 resistance genes and main resistant gene werePib,Pi-kh,Pi-km,Pi2,Pi9 andPita. These materials could provide new resistance genes for breeding new rice varieties with blast resistant by MAS.

Rice; Germplasm; Rice blast resistance gene; Molecular marker

2016-01-04

2016-02-26

Ningxia Natural Science Foundation (No. NZ14005).

ZHANG Yinxia, female, associate professor. Research area: rice genetics and breeding. E-mail: zyinxia2008@126.com

(责任编辑：郭柏寿Responsible editor:GUO Baishou)

2016-01-04修回日期：2016-02-26

宁夏自然科学基金(NZ14005)。

张银霞，女，副教授，研究方向为水稻遗传育种。E-mail：zyinxia2008@126.com

S511.2+2 文献标志码A文章编号1004-1389(2016)07-0989-08

网络出版日期：2016-06-30

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1624.012.html