早胜牛及其杂交类群 IGF-Ⅱ基因多态性与肉用性状关联分析

2016-07-14徐建峰张艳丽容维中

西北农业学报 2016年7期

关键词：肉块肉用类群

徐建峰，张艳丽，容维中，王　珂

(1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉　744000； 2.平凉市农产品质量安全检测检验中心，甘肃平凉　744000)

早胜牛及其杂交类群 IGF-Ⅱ基因多态性与肉用性状关联分析

徐建峰1，张艳丽2，容维中1，王珂1

(1.甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000； 2.平凉市农产品质量安全检测检验中心，甘肃平凉744000)

为研究 IGF-Ⅱ基因多态性对胴体性状和肉质性状的影响，采用PCR-SSCP和DNA测序技术检测早胜牛及其杂交类群(南德温×早胜牛杂交一代、安格斯×早胜牛杂交一代) IGF-Ⅱ基因第2外显子的遗传多态性，分析不同基因型与肉用性状的相关性。结果表明，检测到1个SNPs (T116C)，等位基因E和基因型EF频率分别为0.56和0.40，为优势等位基因和基因型；相关分析显示，屠宰率和优质肉块占宰前活质量比例FF型显著高于EE和EF型，净肉率EE型显著高于FF和EF型，背膘厚度FF和EE型都显著高于EF型，剪切力FF型显著低于EE和EF型。以上结果说明， IGF-Ⅱ基因第2外显子可以作为早胜牛肉用方向选育的有效分子标记。

早胜牛； IGF-Ⅱ 基因；PCR-SSCP；肉用性状；选育

早胜牛是甘肃省引入陕西秦川牛，经过长期人工驯化和杂交选育形成的地方群体，属于秦川牛的优秀类群之一，于1986年被列入《甘肃省畜禽品种志》[1]，现主要分布在陇东黄土高原沟壑山区，年饲养量近5万头，是当地养殖的主导肉牛群体。近年来，人们对优质高档牛肉数量和质量的要求越来越高，早胜牛特有的脂肪沉积好、肉质细嫩等品质逐渐受到广大消费者的青睐。同时，随着分子生物学技术的快速发展，在基因组水平开展早胜牛的肉用性能研究对其遗传改良和种质资源创新是非常必要的。

IGFs家族是一种多肽类激素，对脊椎动物的生长和发育具有重要作用[2-3]。Froesch等[4]在血清中发现不能被胰岛素抗体所中和的生长因子，将其命名为非抑制性胰岛素样活性(NSILA)。Rinderknecht等[5]通过NSILA测序方法发现不同的生长因子，它们在结构和功能上都与胰岛素相似，由此被命名为 IGF-Ⅰ和 IGF-Ⅱ。其中， IGF-Ⅱ基因属于母系印记父系表达基因，全长8.8 kb，由10个外显子和9个内含子组成，因其对胚胎发育、肌肉生长和分化、基因组印迹等方面具有重要的调节和促进作用，已成为研究畜禽生长发育和肉质性状的重要候选基因[6-7]。目前肉牛生产盲目追求引种和杂交改良，忽视地方黄牛遗传资源的保护和利用，对品质内涵和肉用潜力的挖掘远远不够，导致品种选育进展缓慢[8]。

基于此，本研究采用PCR-SSCP和DNA测序技术对早胜牛及其杂交类群 IGF-Ⅱ基因第2外显子多态性及其与肉用性状的相关性进行分析，以期筛选出影响产肉率、肌肉嫩度、脂肪沉积等性状的SNPs，为进一步了解早胜牛生产优质牛肉的遗传特性及潜力、加快甘肃现代肉牛新品群选育提供基础数据。

1材料与方法

1.1试验材料

30头早胜牛及其杂交类群(南德温×早胜牛杂交一代、安格斯×早胜牛杂交一代)均选自庆阳市宁县兴旺牧业有限责任公司，在同一饲养条件下集中育肥。采用静脉采血法每头牛采血7 mL，加入柠檬酸葡萄糖抗凝后低温条件下带回实验室，于-20 ℃保存。根据《GB/19477-2004 牛屠宰操作规程》，在泾川县食品有限责任公司对试验牛只进行屠宰试验，测定宰前活质量、屠宰率、净肉率、优质高档肉块质量、眼肌面积、背膘厚度7个胴体性状和剪切力、熟肉率、失水率、大理石纹、pH值5个肉质性状。

1.2基因组DNA提取与检测

采用Omegabiotek公司生产的D3471型血液DNA提取试剂盒提取基因组DNA，用10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和分光光度计检测OD260/OD280值。

1.3引物设计与PCR扩增

参照Genbank公布的 IGF-Ⅱ基因核苷酸序列(登录号：DQ298739)，采用Prime 5.0 软件设计特异性引物，由北京三博远志生物技术有限责任公司进行合成。引物序列：上游5′-CCTCAGCCTCATCCCCTCCTTTGC-3′，下游5′-CT-GTGCTCTATTTGCTGTGTTGTCT-3′。

PCR反应体系：总体积50 μL，其中2×TaqMaster Mix 混合液25 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各2 μL，DNA模板(100 ng/μL)2 μL，ddH2O 19 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min，34个循环(94 ℃变性5 min，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4SSCP检测与基因测序

取2 μL PCR产物与6 μL变性缓冲液(φ=98%的甲酰胺、10 mmol/L EDTA、0.25 g/L的溴酚蓝、0.25 g/L的二甲苯青)混匀，98 ℃变性10 min，冰浴5 min，然后上样于12%、交联度为29∶1的非变性聚丙烯酰胺凝胶，220 V、4 ℃恒温恒压电泳16 h。电泳结束后银染法染色和判型。根据SSCP检测结果，将不同基因型产物送至北京三博远志生物技术有限公司进行纯化和测序。

1.5数据处理与分析

利用 PopGen 32 软件计算基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数(Ne)、纯合度(Ho)、杂合度(He)，利用PIC CALC V 0.6软件计算多态性信息含量(PIC)。根据影响肉质性状的不同因素，建立最小二乘线性模型，采用SPSS 13.0 软件对 IGF-Ⅱ基因第2外显子不同基因型与胴体性状和肉质性状进行关联分析。

最小二乘线性模型：

yijkmn=μ+Farmi+Breedj+Agek+Sexm+Markern+eijkmn

其中：yijkm为个体表型记录，μ为群体均值，Farmi为场别效应，Breedj为品种效应，Agek为年龄效应，Sexm为性别效应，Markern为标记基因型效应，eijkm为随机误差。

2结果与分析

2.1PCR-SSCP检测

对早胜牛及其杂交类群 IGF-Ⅱ基因第2外显子进行扩增，结果显示，PCR扩增产物条带清晰，无非特异性条带，且片段长度与目的条带大小一致(图1)。经SSCP检测和测序后发现，在第2外显子116 bp处发生T/C的单碱基突变(图2)，产生2个等位基因(E、F)和3种基因型(EE、FF、EF)(图3)。

M.DL2000 Marker; 1～6.PCR产物PCR amplifications

图1 IGF-Ⅱ 基因 PCR 扩增产物

Fig.1Amplifications of IGF-Ⅱ gene

图2　 IGF-Ⅱ 基因不同基因型测序

2.2遗传多态性分析

遗传多态性分析结果表明(表1)，30头早胜牛及其杂交类群中，E的基因频率和EF基因型频率最高，分别为优势等位基因和优势基因型。纯合度、杂合度、有效等位基因数、多态信息含量通常用来衡量一个群体的遗传变异程度，该群体纯合度、杂合度、有效等位基因数分别为0.69、0.31和1.45，多态信息含量为0.42，属于中度多态，表明早胜牛及其杂交类群多态性较为丰富，人工选择潜力较大。

2.3 IGF-Ⅱ基因多态性与肉用性状的相关性分析

早胜牛及其杂交类群 IGF-Ⅱ基因第2外显子不同基因型与其肉用性状的相关性分析结果表明

图3　 IGF-Ⅱ基因 PCR-SSCP 检测

(表1)，不同基因型与屠宰率、净肉率、剪切力、背膘厚度、优质肉块质量占宰前活质量的比例具有相关性，而与其他3个胴体性状和4个肉质性状的相关性不显著(P>0.05)。其中，屠宰率FF型显著高于EE和EF型(P<0.05)，但后两者差异不显著(P>0.05)；净肉率3种基因型间存在显著性差异(P<0.05)，且EE型>FF型>EF型；优质肉块质量占宰前活质量比例中FF型显著高于EE和EF型(P<0.05)；背膘厚度FF型和EE型差异不显著(P>0.05)，但都显著高于EF型(P<0.05)；剪切力FF型显著低于EE和EF型(P<0.05)。其他指标的平均数以FF型较大，如宰前活质量、高档肉块质量占宰前活质量比例、眼肌面积、大理石纹等。

从相关性分析结果来看， IGF-Ⅱ基因第2外显子不同基因型对早胜牛及其杂交类群部分肉用性状具有显著影响(P<0.05)，可以作为肉用遗传资源选育的分子标记基因。根据专用化肉牛品种的选育方向，从改善和提高肉用性能的角度出发，优先选留FF基因型个体，淘汰EF和EE基因型个体，可以提高群体的生产水平和选育质量。

表1　 IGF-Ⅱ 基因第 2 外显子遗传多态性

表2　 IGF-Ⅱ 基因第 2 外显子不同基因型与肉用性状的关联性

注：数值为“平均数±标准误”。同行数值后不同字母表示差异显著 (P<0.05)。

3讨论

3.1 IGF-Ⅱ基因第2外显子的遗传特征

IGF-Ⅱ基因在不同片段具有较高的多态性，已经发现多处SNPs位点[9-11]。本研究在 IGF-Ⅱ基因第2外显子检测到1个SNP位点(T116C)，发现E、F 2个等位基因和EE、EF、FF 3种基因型，这与前人在不同牛种中检测的结果类似[12-13]。关于牛 IGF-Ⅱ基因在其他位点是否存在多态性，还有待进一步验证。

杂合度 (He)、多态信息含量(PIC) 的大小可以用来反映群体遗传变异水平的高低，其数值越大，表明群体遗传多样性越丰富，选择潜力越大。早胜牛及其杂交群体第2外显子的群体杂合度和多态信息含量分别为0.31和0.42，属于中度多态，这与早胜牛杂交选育中导入外来品种引起遗传结构变化和生活环境不同等因素有关，表明该位点多态性较为丰富，后期肉用方向选育中应加大人工选择的强度，以提高群体生产水平。

3.2 IGF-Ⅱ基因多态性与肉用性状的相关性

Vykoukalova 等[14]研究表明， IGF-Ⅱ基因内含子7 存在多态性，且基因型与背膘厚和瘦肉率呈显著相关。Jeon等[9]在欧洲野公猪×大白猪参考系 IGF-Ⅱ基因中定位1个影响肌肉表达的QTL，发现该位点对眼肌面积、背膘厚度、肉质等性状的影响非常明显。Oksbjerg等[15]发现，绵羊中 IGF-Ⅱ基因的表达量与背膘厚度呈正相关，且影响背膘厚度。综上， IGF-Ⅱ基因可以作为肉用性状与标记间连锁分析的候选标记，本研究结果也证实上述观点。 IGF-Ⅱ基因第2外显子多态性与早胜牛及其杂交类群肉用性状的相关分析结果显示，基因型对屠宰率、净肉率、背膘厚度、优质肉块占宰前活质量比例和剪切力具有显著影响，其中，屠宰率和优质肉块占宰前活质量的比例，FF型都显著高于EE型和FF型；净肉率和背膘厚度，FF型和EE型都显著高于EF型；剪切力，FF型显著低于EE和EF型。根据牛肉等级分级标准和消费者对牛肉质量的市场需求，从生产优质高档牛肉的角度考虑，在牛肉嫩度、优质高档肉块的重量、脂肪沉积等方面，以FF型个体肉质最佳，这与早胜牛特有的肉质细嫩、脂肪沉积好的品质相符，也说明在长期人工选择中，部分个体已经向专门化肉用方向改良。因此，建议将FF基因型作为早胜牛肉用方向选育的有效标记，进一步加大人工选择强度，坚持选留含有FF型的优秀个体，提高优势基因纯合度，更好的指导早胜牛的育种工作，为肉牛肉质性状遗传改良和种质创新提供基础数据。

3.3早胜牛肉用开发前景

早胜牛作为秦川牛的优秀类群，经过多年改良，在体型外貌、产肉率等方面较好地继承秦川牛生长发育快、脂肪沉积好的特性[16]，是甘肃省黄牛杂交改良的主打品种。通过18个月集中育肥和屠宰测定，屠宰率变幅为55.81%～60.75%，净肉率变幅为48.65%～53.30%，眼肌面积变幅为72.67～76.50 cm2，优质肉块质量占宰前活质量比例约7%，高档肉块质量占宰前活质量比例约为16%，肉用性能较本地黄牛及杂交后代得到明显改善，具有生产优质高档牛肉的内在潜质和培育现代肉牛的外在特征。如果后期限制秦川牛的杂交利用，加快培育自有种公牛，逐步使早胜牛具有更稳定的品种特征，并应用传统育种和分子育种技术相结合对早胜牛进行群体内选育提高和横交固定，有望培育成肉牛新品种(类群)。

Reference：

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Association Analysis between Polymorphism of IGF-Ⅱ Gene in Exon 2 and Beef Performance Traits in Zaosheng Cattle and Hybrid Groups

XU Jianfeng1,ZHANG Yanli2,RONG Weizhong1and WANG Ke1

(1.Gansu Provincial Animal Husbandry and Veterinary Research Institute , Pingliang Gansu744000, China;2.Examing and Inspection Center for Agricultural Product Safety and Quality of Pingliang City, Pingliang Gansu744000, China)

In order to study polymorphism of IGF-Ⅱ gene (Insulin-like growth factor-Ⅱ ) and its influence with characteristics of carcass and meat quality traits. PCR-SSCP and DNA sequencing technologies were conducted to detect heredity polymorphism of IGF-Ⅱ gene in exon 2 with Zaosheng cattle (Bostaurus) and hybrid groups(Hybrid of South Devon with Zaosheng cattle, hybrid of Angus with Zaosheng cattle), and analyze the correlation of different genotypes with beef performance traits.The results indicated that there was a base mutation at c. 116 T > C of exon 2, which leaded to three genotypes such as EE, EF and FF. The alleles E with the frequency of 0.56 and genotype EF with the frequency of 0.40,were the highest. Before slaughter of FF genotype, dressing percentage and proportion of high quality meat in live mass were significantly higher than that of EE genotype and EF genotype,percentage of net meat of EE genotype was significantly higher than that of FF and EF genotype, Backfat thickness with FF genotype and EE genotype were significantly higher than that of EF genotype, shear force with EE genotype and EF genotype were significantly higher than that of FF genotype. Therefore these results suggested that the exon 2 mutation of IGF-Ⅱ gene could be maker to beef performance breeding with Zaosheng cattle.

Zaosheng cattle; IGF-Ⅱ gene;RCP-SSCP; Beef performance traits;Breeding

2016-01-18

2016-03-10

Project for Technology Research and Development of Gansu Province(No.1207TCYL016).

XU Jianfeng, male, assistant research fellow.Research area:molecular biology.E-mail:xjf_fx@126.com

WANG Ke, male, associate research fellow. Research area:animal breeding technology. E-mail:710401384@qq.com

(责任编辑：顾玉兰Responsible editor:GU Yulan)

2016-01-18修回日期：2016-03-10

甘肃省技术研究与开发专项计划(1207TCYL016)。

徐建峰，男，助理研究员，从事分子生物学研究。E-mail:xjf_fx@126.com

王珂，男，副研究员，主要从事动物繁育技术研究。E-mail:710401384@qq.com

S813.3