羊源C型产气荚膜梭菌的分离鉴定、药敏试验及免疫治疗

2016-07-14叶宝宏许信刚付明哲

西北农业学报 2016年7期

关键词：荚膜产气梭菌

叶宝宏，冯　平，许信刚，付明哲

(1.榆林学院生命科学学院，陕西榆林　719000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌　712100)

羊源C型产气荚膜梭菌的分离鉴定、药敏试验及免疫治疗

叶宝宏1，冯平1，许信刚2，付明哲2

(1.榆林学院生命科学学院，陕西榆林719000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100)

从陕北某绵羊养殖场猝死绵羊的肝脏和脾脏中分离得到1株细菌，通过细菌培养特性、菌体形态、菌落特征、染色特性、生化试验、外毒素测定、毒素类型的PCR检测和药敏试验等鉴定，结果表明，该分离菌为革兰氏阳性大杆菌，生长特性和生化试验结果符合产气荚膜梭菌的所有特点；该菌可产生致小白鼠死亡的外毒素，PCR检测结果证实外毒素为α毒素和β毒素；药敏试验结果表明，该菌对环丙沙星、诺氟沙星等抗生素高度敏感，对庆大霉素、卡那霉素等抗生素不敏感。表明该菌为引起绵羊猝狙的C型产气荚膜梭菌，用羊梭菌疫苗紧急免疫羊群并配合应用抗生素治疗能有效控制该病的流行。

绵羊；C型产气荚膜梭菌；分离鉴定；毒素；药敏试验

产气荚膜梭菌(Clostridiumperfrungeus)，又称魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，为芽胞杆菌科梭状芽胞杆菌属成员。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性菌，菌体呈粗杆状，边缘笔直，菌端较齐，单个或成双排列，有时可见短链，是温和的厌氧菌[1-2]。产气荚膜梭菌为典型的条件致病菌，正常情况下广泛分布于自然界和人畜肠道中，与动物肠道其他菌群保持相对平衡，当外界环境发生变化时会大量增殖，产生外毒素，表现出致病性。产气荚膜梭菌可以产生α、β、ε、ι等多种外毒素，依据毒素中和试验可将该菌分为A、B、C、D和E 5个毒素型，羊源产气荚膜梭菌多为B型和C型[3-4]。产气荚膜梭菌感染临床表现为羊猝死症、肠毒血症、羔羊腹泻等，其发病急、病程短、死亡率高，给养殖业造成严重的经济损失[4-5]。

羊猝狙是由C型产气荚膜杆菌引起的，以急性死亡为特征、伴有腹膜炎和溃疡性肠炎的一种毒血症。该病多因羊采食被C型产气荚膜梭菌污染的饲料或饮水，细菌进入小肠大量繁殖，产生毒素，引起羊发病。该病病程短促，多未见症状即突然死亡。有时病羊出现掉群、卧地、精神不安，机体衰弱、昏迷或痉挛，常于数小时内死亡。羊猝狙主要发生于1～2岁的成年绵羊，常流行于低洼、潮湿地区，以冬春季节多发，主要经消化道感染，呈地方性流行[6]。2015年秋季陕北某绵羊养殖场多只绵羊突然发病，卧地痉挛，很快死亡，死亡羊膘情较好，剖检发现十二指肠和空肠粘膜严重出血、溃烂，胸腔、腹腔及心包有积液，浆膜上有小的出血点。笔者采集病料并进行一系列试的系统鉴定，确定为羊源C型产气荚膜梭菌引起的绵羊猝狙。对该场羊群用“羊快疫、羊猝狙、羊肠毒血症、羔羊痢疾”四联菌苗进行紧急免疫接种，其余病羊用敏感抗生素药物治疗，有效地控制该病的进一步流行，现将病原菌分离鉴定及免疫防治结果予以报道。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料采集2015年采自陕北某绵羊养殖场病死绵羊的肝脏、脾脏等病变组织。

1.1.2主要培养基厌气肝汤培养基、梭菌增菌培养基、鲜血琼脂、普通琼脂、麦康凯琼脂、铁钉牛乳培养基、半固体糖发酵培养基、M-R、V-P试验用培养基按文献[7]的方法制备。

1.1.3主要试剂焦性没食子酸，φ=10% NaOH、M-R、V-P、接触酶试验用试剂，革兰氏染色液，美兰染色液，鞭毛、荚膜、粘液层、芽胞染色液按文献[7]的方法制备；药敏纸片购自上海卫生技术服务公司生物试剂所；2×EsTaqMaster Mix，DNA Marker DL2000，细菌基因组提取试剂盒等购于北京康为世纪生物科技有限公司；引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。

1.1.4试验动物小白鼠购自第四军医大学实验动物中心。

1.2方法

1.2.1病羊临床症状检查及剖检记录羊发病过程及临床表现，进行常规剖检。

1.2.2细菌的分离与鉴定无菌法采取肝脏、脾脏组织直接接种到厌气肉肝汤培养基进行增菌培养，培养24 h后转接至鲜血琼脂平板上，厌氧罐培养过夜，挑取单个菌落，经涂片、革兰氏染色、显微镜查检证实为纯培养物，将其接种于鲜血琼脂斜面上进行厌氧培养，得到纯培养物。

1.2.3形态结构、染色特性与运动性检查按文献[7]的方法进行。

1.2.4培养特性试验分离菌接种于普通琼脂平板、鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、厌气肝汤等培养基中，于厌氧罐中37 ℃培养观察其生长表现。另一组37 ℃有氧条件下培养24 h观察其生长表现。

1.2.5生化试验根据《常见细菌系统鉴定手册》中关于产气荚膜梭菌的生化图谱[8]，将分离菌纯培养物接种于各种生化培养基中，包括糖发酵试验(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、棉籽糖、甘露醇、水杨苷)、吲哚试验、H2S试验、MR试验、硝酸盐还原试验、卵磷脂酶试验、明胶液化试验和牛乳暴烈发酵试验，37 ℃厌氧培养24 h，观察记录结果，通过细菌生长表现判定种属。

1.2.6药敏试验按文献[9]的纸片扩散法操作及判定。

1.2.7外毒素检测将病原菌接种于梭菌增菌培养基，37 ℃摇床培养(180 r/min )24 h，培养物经10 000 r/min离心30 min，取上清液，用0.22 μm孔径细菌滤器过滤，得到含外毒素的滤液。将8只小白鼠随机分为对照组和试验组，每组 4 只，试验组每只通过尾静脉注射滤液0.2 mL，对照组注射同样剂量的生理盐水，观察和记录发病及死亡情况。

1.2.8单项和多重PCR鉴定毒素类型参考文献[10]的方法，针对4种毒素基因设计4对特异性引物。引物序列为α-F：GCTAATGTTACTGCCGTTGA，α-R：CCTCTGATACATCGTGTAAG；β-F：ACTATACAGACAGATCATTC- AACC，β-R：TTAGGAGCAGTTAGAACTAC- AG；ε-F：AGTATCTAATGAAATGTCCA，ε-R：TTCCACTTACTTGTCCTAC；ι-F：ACTACT- CTCAGACAAGACAG，ι-R：CTTTCCTTCTA-TTACTATACG，目的片段大小依次为325、236、584和443 bp。将各引物浓度稀释至20 μmol/L，-20 ℃保存，备用。以病原分离培养中的单菌落为模板，用4种毒素型对应的引物进行单项和多重PCR扩增。单项PCR反应体系为25 μL：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，挑取单菌落为模板，灭菌双蒸水10.5 μL。多重PCR反应体系为50 μL：2×EsTaqMasterMix 25μL，α、β、ε、ι上下游引物分别加0.15、0.5、2、0.75 μL，挑取单菌落为模板，灭菌双蒸水21.6 μL；并取双蒸水作为阴性对照的模板，进行PCR。反应程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；最后72 ℃延伸8 min。PCR完成后，电泳后用凝胶成像系统观察结果并拍照。

1.2.9免疫防治病死羊销毁进行无害化处理，清理圈舍粪便，羊舍及饲养用具用φ=0.1%的“百毒杀”溶液全面彻底消毒。未发病的羊只用“羊快疫、羊猝狙、羊肠毒血症、羔羊痢疾”四联菌苗紧急接种免疫。病程稍长的病羊用敏感抗生素药物，配合强心、镇静等对症治疗。

2结果与分析

2.1临床症状及剖检结果

发病羊只多为1～2岁膘情较好的绵羊，表现发病突然、病程短促，有的未见到症状突然死亡。剖检病死羊数只，病变基本一致(图1)。十二指肠和空肠黏膜严重充血、溃烂，有的区段可见到溃疡，胸腔、腹腔及心包大量积液，暴露于空气后形成纤维素性絮状凝块，浆膜上有出血状小点。

2.2细菌分离结果

从死亡羊的肝脏、脾脏等部位均分离到一株具有双层溶血环，内环为β溶血，外环为α溶血的纯细菌培养物。

图1　十二指肠和空肠黏膜出血、坏死和溃疡

2.3形态结构及染色性

分离菌为革兰氏阳性菌，菌体呈粗大的直杆状，两端圆形，多单个或成双排列，短链很少出现，无鞭毛，不能运动，大小为(0.6～2.4) μm ×(1.3～19.0) μm，有芽胞，芽胞位于菌体中央，有荚膜，无粘液层，菌体无两极着色现象(图2)。

2.4培养特性

分离菌为厌氧菌，在普通琼脂平板上37 ℃培养24 h后，形成圆形、表面光滑湿润、边缘整齐、灰白色半透明的中等大小菌落；在血琼脂平板上生长好，37 ℃、24 h即可形成直径2～5 mm灰白色、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状的中等大小菌落，菌落周围呈明显的β溶血；在麦康凯琼脂平板上不生长；在厌氧肉肝汤中培养5～6 h即呈均匀浑浊，并产生大量气体；在铁钉牛乳培养基中6～8 h，牛乳呈现出“暴烈发酵”现象；在梭菌増菌培养基中呈均匀浑浊，或有黏稠沉淀物。

图2　产气荚膜梭菌革兰氏染色结果(1 000×)

2.5生化特性

分离菌株接种各种生化培养基后，可观察到所有分离株均能发酵葡萄糖、乳糖、麦牙糖、蔗糖、棉籽糖产酸产气，不分解甘露醇和水杨苷，靛基质试验阴性，硝酸盐还原阳性，卵磷脂酶试验阳性，产生硫化氢，液化明胶。生化试验结果见表1，根据《伯杰氏细菌鉴定手册》中关于产气荚膜梭菌的生化图谱，可初步判定分离到的菌株为产气荚膜梭菌。

2.6药敏试验结果

药敏试验结果表明，分离菌对链霉素、环丙沙星、诺氟沙星、左氟沙星、杆菌肽、氯霉素、万古霉素、头孢曲松、替卡西林等抗生素高度敏感；对氨苄西林、克林霉素、红霉素、头孢唑林等抗生素中度敏感；对庆大霉素、卡那霉素、磺胺异恶唑、复方新诺明、强力霉素、四环素、氨苄西林、甲硝唑、克林霉素、青霉素等抗生素不敏感。

表1　分离菌株的生化试验结果

注: “⊕ ”表示产酸产气；“+”表示产酸或阳性；“-”表示不产酸，为阴性。

Note: “⊕”acid-producing and gas-forming; “+”positive,acid producing；“-”negative,no acid producing.

2.7外毒素致病性试验结果

小白鼠注射外毒素后，10～60 min内表现为呼吸困难，行动迟缓，2 h内试验小鼠全部死亡，对照组小白鼠存活无异常。无菌操作剪取肝组织块，用断面抹片显微镜观察，未观察到细菌。将组织块在血琼脂平板上划线，37 ℃厌氧培养24 h也无菌落生长，表明小白鼠的死亡是由外毒素所致。

2.8PCR结果

单项PCR扩增结果可观察到325 bp 的α毒素(图3第1泳道)、236 bp的β毒素(图3第2泳道)的特异条带，没有出现584 bp的ε毒素(图3第3泳道)和443 bp的ι毒素(图3第4泳道)的特异条带；多重PCR扩增可观察到325 bp 的α毒素、236 bp的β毒素的特异条带，没有出现584 bp的ε毒素和443 bp的ι毒素的特异条带(图3第5泳道)，阴性对照无任何条带(图3第6泳道)。由于C型产气荚膜梭菌可产生α毒素和β毒素，因此可确定分离菌为C型产气荚膜梭菌。

M. DNA Marker DL2 000；1～4. 单项PCR扩增产物Result of simplex PCR；5.多重PCR扩增产物Result of multiplex PCR；6. 阴性对照Negative control

图3PCR结果

Fig.3Result of PCR

2.9免疫治疗结果

给所有羊只进行梭菌疫苗紧急接种，对精神状况不好的羊进行敏感药物抗生素治疗。该场羊群再没有发生死亡病例，疫病得到有效控制。

3讨论

羊猝狙多因羊采食被C型产气荚膜梭菌污染的饲料或饮水，细菌进入小肠大量繁殖，产生毒素，引起羊发病。该病病程短促，未见出现临床症状，病羊表现掉群、卧地、烦躁不安、机体衰弱、全身痉挛，毒素侵害神经中枢的神经元，患羊可在数小时内死亡。绵羊以1～2岁的绵羊发病，常流行于低洼、潮湿地区和冬春季节，主要经消化道感染，呈地方性流行。产气荚膜梭菌在自然界分布极广，对厌氧条件要求不高，一般的厌氧条件下能生长，暴露于空气中60 min仍能存活。可见于土壤、污水、饲料、食物、粪便以及人畜禽肠道等，其主要以芽胞形式存在。产气荚膜梭菌生长对营养水平要求不高，在普通培养基上即可生长，若在琼脂培养基加入葡萄糖和血液则生长的更好。该菌生长非常迅速，在适宜的条件下增殖一代时间仅为8 min[3-4]。本研究从临床症状表现观察到该病发病急，死亡快，且发病羊只多为1～2岁膘情较好的绵羊。表现为发病突然，病程短促，有的未见到明显症状就突然死亡。有时发现病羊掉群、卧地、表现不安、衰弱和痉挛，在数小时内死亡。剖检病死羊数只，病变基本一致，表现为十二指肠和空肠黏膜严重充血、溃烂，有的区段可见溃疡，胸腔、腹腔及心包大量积液。以上这些症状呈典型的坏死性肠炎病变，从而怀疑为羊猝狙。分离菌通过培养特性、菌体形态、菌落形态、染色特性、毒素致病性试验、生化试验及毒素型别的PCR检测等一系列的系统鉴定，进一步确诊为该羊病是由C型产气荚膜梭菌引起的绵羊猝狙。

产气荚膜梭菌的致病性与其产生的毒素有关，目前已知至少可以产生15种毒素，根据产气荚膜梭菌产生4种致死性毒素(α、β、ε、ι毒素)的能力，将其分为5种血清型，即A、B、C、D、E型。A型产生α毒素，B型产生α、β和ε毒素，C型产生α和β毒素，D型产生α和ε毒素，E型产生α和ι毒素。α毒素具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。β毒素分为β1、β2毒素，β1毒素是一种强毒素，具有细胞毒性、致死性，β2毒素是近年确认由C型产气荚膜梭菌产生的新毒素，与β1毒素相似，是一种强毒素，具有细胞毒性和致死性。ε毒素是B型和D型菌株的主要毒力因子，已确定其为一种成孔毒素，是最为烈性的细菌毒素之一。ι毒素具有细胞毒、致死和致皮肤坏死活性。目前国内对产气荚膜梭菌的研究大多集中在α和β1这2种外毒素，且主要进行这2个毒素基因的克隆与表达，对β2和ε毒素进行研究的报道极少，对ι毒素的研究几乎是一片空白。然而产气荚膜梭菌对中国畜牧业产生巨大危害，因此有必要加强产气荚膜梭菌主要外毒素的基础和应用研究[4,11]。已有试验建立产气荚膜梭菌菌落多重PCR方法并应用于临床检测，效果较好[10,12-13]。本试验单项PCR检测到α和β毒素基因，没有检测到ε和ι毒素基因；多重PCR检测到α和β毒素基因，没有检测到ε和ι毒素基因。由于C型产气荚膜梭菌只产生α和β毒素，因此可确定分离菌为C型产气荚膜梭菌。

针对该病应实行有效的防治措施，及时隔离病羊、严格消毒，把羊群中表现异常的羊只立即挑出隔离，病死羊销毁进行无害化处理，清理圈舍粪便，对羊舍及饲养用具进行全面彻底消毒。未发病的羊只用“羊快疫、羊猝狙、羊肠毒血症、羔羊痢疾”四联菌苗紧急接种免疫。该病由于病程短促，往往来不及治疗已死亡。病程稍长者，用C型魏氏梭菌抗血清治疗，或应用抗生素及磺胺类药物，配合强心、镇静等对症治疗，可取得一定效果。对危害较严重的细菌性传染病，还应坚持以预防为主的原则，提前对全群进行四联菌苗接种免疫，只有这样才能达到控制和最终消灭某些细菌和传染病的目的[4]。近年来，随着抗生素的广泛应用及滥用，导致产气荚膜梭菌耐药问题日趋显现，已有研究[14]发现产气荚膜梭菌对首选抗生素治疗药物克林霉素、青霉素、甲硝唑耐药程度较高，对次选抗生素治疗药物替卡西林、头抱曲松等较低，因此应避免滥用抗生素，否则会导致病原菌获得不同程度的抗药性，给细菌性疾病防治带来困难，也会对食品安全和人类健康带来风险。

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Isolation,Identification,Drug Sensitivity Test and Immunotherapy ofClostridiumperfringensType C in Sheep

YE Baohong1,FENG Ping1,XU Xingang2and FU Mingzhe2

(1.School of Life Science of Yulin University,Yulin,Shaanxi719000,China;2.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

A strain bacteria was isolated from liver and spleen of a sudden death sheep in Northern Shaanxi . A series of experiments including cultivating characteristic,bacteria morphology,colony morphology,staining characteristics,determination of exotoxin,biochemical test,PCR test for toxin type identification were done in order to identity pathogenic bacteria. Isolated bacteria was gram-positive bacteria,results of growth characteristic and biochemical test were accorded with all characteristics ofClostridiumperfringens. This bacteria could produce the exotoxin which can cause the death of mice. PCR results confirmed that the exotoxin of this bacteria were α and β toxins. Drug susceptibility test showed that the bacteria was sensitive to ciprofloxacin,norfloxacin and not sensitive to gentamicin,kanamycin.All the results showed that the bacteria strain isClostridiumperfringenstype C. Sheep are urgently injected with sheep clostridium vaccine and treated with sensitive antibiotics,and the disease is controlled effectively in sheep.

Sheep；Clostridiumperfringenstype C；Isolation and identification；Toxin；Drug sensitivity test

2016-03-01

2016-03-19

Shaanxi Province Program for Science and Technology Development (No.2015NY162).

YE Baohong,male,master.Research area: animal infectious diseases. E-mail：79971294@qq.com

FU Mingzhe,male,senior veterinarian.Research area:sheep disease. E-mail:1692831800@qq.com

(责任编辑：顾玉兰Responsible editor:GU Yulan)

2016-03-01修回日期：2016-03-19

陕西省科技攻关(2015NY162)。

叶宝宏，男，硕士，从事动物传染病研究。E-mail：79971294@qq.com

付明哲，男，高级兽医师，主要从事羊病研究。E-mail：1692831800@qq.com

S852. 61