河南太行山区野生山葡萄表皮酵母菌的分离与鉴定

张俊杰，杨　旭，张文叶，刘崇怀（.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州45000；.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）



河南太行山区野生山葡萄表皮酵母菌的分离与鉴定

张俊杰1，杨旭1，张文叶1，刘崇怀2
（1.郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450002；2.中国农业科学院郑州果树研究所，河南郑州450009）

摘要：为了获取更多的野生酵母优质菌种资源，本研究采用传统的微生物分离手段，从河南辉县太行山区的野生葡萄表皮共分离纯化得到6株酵母菌（W1—W6）。首先采用形态学观察方法对其进行初步分类，然后采用26S rDNA D1/D2区域序列系统发育分析，对6株酵母菌进行分子生物学鉴定。形态学初步鉴定结果表明，6株酵母菌呈现出菌落形态、细胞显微形态、子囊孢子形态和液体生长特征的多样性，并初步归为5个形态学群；而26S rDNA D1/D2区序列分析结果表明，6株供试菌分别属于酵母菌4个属的5个种：Hanseniaspora uvarum（W1）、Metschnikowia pulcherrima（W2）、Metschnikowia fructicola（W3）、Debaryomyces hansenii（W4和W6）和Pichia fermentans（W5）。该结果与形态学鉴定结果一致，共同确定了对6株酵母菌菌株的鉴定结果。该结果也丰富了对野生山葡萄蕴含酵母菌资源的认识。

关键词：微生物；野生山葡萄；酵母菌；26S rDNAD1/D2；分离鉴定

优先数字出版时间：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1335.002.html。

我国葡萄种植分布广泛，由于不同产区的生态条件差异较大，葡萄品种较多，其所含酵母菌种类也有较大差异［1］。葡萄酒酿造是一个复杂的微生物代谢过程，其中酵母菌是最重要的微生物菌群［2］。酵母作为主要的发酵微生物不仅对葡萄酒质量和发酵过程影响很大，而且对葡萄酒色泽、香气、感官质量及风格的形成有重要贡献。用不同菌株发酵生产的葡萄酒，其酒质和风味差别很大。所以寻找能够适应当地葡萄原料特性，并且有利于形成地域葡萄酒风格的新土著酵母菌株及新酵母种已成为研究的焦点［3］。酵母菌是葡萄酒酿造的关键因素之一，其遗传多样性分析和分类鉴定是选育优良酿酒酵母菌种的重要基础［4-5］。但并非所有酵母菌都能够起到有益的作用，在一些野生的葡萄中还可能含有亟待开发的优质酿酒酵母种群。因此，鉴定腐败葡萄中酵母菌的种类，有助于抑制葡萄中败坏性酵母的负面影响［1］，而鉴定野生葡萄中的酵母菌种群，则有利于发现更多优质的酿酒酵母，为我国葡萄酒酿造积累更多的酵母菌种资源。

葡萄酒相关酵母迄今为止已发现有20多个属的百余种，几乎遍及酵母的主要属种［3］。受到环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面的差异并不显著，采用传统方法对其进行准确分类就显得相当困难［6］。随着DNA序列分析技术的日趋成熟和简化，rRNA基因（rDNA）序列分析已经被广泛应用于酵母菌的鉴定。大亚基rRNA基因（26S rDNA）中的D1/D2区域，能将绝大部分子囊菌酵母和担子菌酵母的种属区分开来，而种内不同菌株间D1/D2区域序列差异一般在1%以内，碱基差异在1%以上则可能代表着不同的种，由此对酵母进行鉴定分类［7］。

本实验以河南辉县太行山区野生山葡萄为原料，采用形态学和26S rDNAD1/D2区序列分析相结合的方法，对从葡萄表皮分离得到的6株酵母菌进行了表型及分子鉴定，为葡萄表皮酵母菌的检测和鉴定提供参考，也为选育优良的野生葡萄优质酵母菌种资源提供了理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1原料

采自河南省辉县太行山区的野生山葡萄。

1.1.2主要药品和试剂

葡萄糖、酵母粉、琼脂、孔雀绿、番红、碘液、蛋白胨、Taq酶、dNTP、1kb DNA Ladder、酵母基因组提取试剂盒等。

26S rDNA引物：NL-1（5'-GCA TAT CAA TAA GCGGAG GAA AAG- 3'）和NL- 4（5'- GGT CCG TGT TTCAAGACG G-3'）。

1.1.3培养基

YPD培养基：蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、酵母膏10 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，自然pH值。

麦氏培养基：葡萄糖1 g、KCl 1.8 g、酵母膏2.5 g、醋酸钠8.2 g、琼脂20 g、蒸馏水1000 mL，自然pH值。

WL培养基：酵母浸粉4 g、胰蛋白胨5 g、葡萄糖5 g、磷酸二氢钾0.055 g、氯化钾0.425 g、氯化钙0.125 g、硫酸镁0.125 g、氯化铁0.0025 g、硫酸锰0.0025 g、溴甲酚绿2.2 g、琼脂20 g，pH6.5。

1.1.4主要设备与仪器

立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、电热恒温培养箱、显微镜、恒温水浴锅、电泳仪、摇床等。

1.2实验方法

1.2.1酵母菌的分离纯化

首先将完整无破损的葡萄粒放入盛有无菌水的三角瓶中，然后在摇床上振荡0.5 h，超净工作台内吸取三角瓶内的振荡液并做10倍梯度稀释到10-2，在含有100 mg/L氯霉素的YEPD培养基上涂布，最后在28℃恒温箱内培养3～5 d。然后随机挑取不同形态的菌落在含有100 mg/L氯霉素的YEPD培养基平板上划线纯化培养3～5 d，然后随机挑选单菌落在光学显微镜下确认其纯度，并从形态学角度初步判断其是否具有酵母菌的细胞显微特征，对于阳性的菌体首先划线保存于YEPD固体斜面，备用。

1.2.2酵母菌的菌落形态观察

将分离纯化的菌种在YEPD平板上划线并在28℃下活化培养1～2 d，将活化的菌株接种于WL培养基，在培养箱中28℃培养5 d后观察记录菌落颜色和形态，按菌落不同形态特征对菌株进行初步分类。

1.2.3酵母菌细胞显微形态观察

取在WL营养培养基平板上的菌落制成菌悬液，取干净灭菌的载玻片，在中央滴上1滴菌悬液，盖上盖玻片，在酒精灯上方微微加热，干燥固定；然后在盖玻片的一侧滴加碘液，在另一侧用滤纸吸去多余的水，碘液会顺着水流方向浸入盖玻片下，直到将多余的碘液吸完，制片完成，置于普通光学显微镜下观察酵母菌细胞的显微形态。

同时，将活化的菌种接种于麦氏培养基，28℃下培养2～3 d后，进行染色观察菌体细胞的显微形态及是否有子囊孢子产生。将在麦氏培养基上28℃恒温培养后的菌种制成菌悬液涂片，并干燥固定；在涂片上滴加数滴5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌部位，染色1～2 min后用95%vol乙醇冲洗，再立即用水冲去染液；之后用0.5%番红水溶液复染0.5～1 min，水洗干燥；将干燥后的涂片用油镜观察，分辨菌体及孢子，其中孢子为绿色，菌体和孢子囊为红色。

1.2.4酵母菌液体培养特征观察

挑取活化好的菌体接种到装有40 mLYEPD液体培养基的100 mL三角瓶中，28℃静置培养3 d，观察并记录底部有无沉淀，是否产生菌璞，是否沿试管壁向上生长。室温下继续培养4周后再次观察并记录特征。

1.2.5酵母菌26S rDNA D1/D2区序列的PCR扩增、检测及序列测定

酵母菌的DNA提取按照试剂盒说明书进行提取。用引物NL-1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAGGAA AAG-3'）和NL-4（5'-GGT CCG TGT TTC AAGACG G-3'）对菌株26S rDNA D1/D2区域进行PCR扩增，反应条件为：95℃预变性5 min，94℃变性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min 20 s；循环36次；再72℃延伸8 min，-20℃保存。PCR反应采用50 μL反应体系：每管中含PCR缓冲液（10×）5.0 μL；25 mM MgCl223.0 μL；10 mM dNTP 1.0 μL；10 μM NL1和NL4各1 μL；0.5 U/μL DNA聚合酶3 μL；模板DNA 1.0 μL；最后添加ddH2O定容到50 μL。

取2 μL PCR扩增产物与1 μL 6×上样缓冲液混匀后点样到1%的琼脂糖凝胶（已加入Goldview I型核酸染液），然后在100 V电压下，1×TAE电泳缓冲液中电泳30 min，最后在紫外分析仪上检测并初步判断扩增片段的质量和大小。扩增合格的PCR产物送测定。

1.2.6序列的分子系统学分析

测序结果采用DNAman软件进行序列校正，校正后的26S rDNA基因D1/D2区序列在NCBI数据库中进行同源序列搜索比对（BLAST）。获得同源酵母菌株的D1/ D2区序列后，用MEGA6软件的ClustalW功能对所有供试序列进行匹配排列，然后采用Kimura 2-parameter模型构建Neighbor-Joining系统发育树，该分析进行1000次的Bootstraps检验。

1.2.7菌种的保藏

菌种的保藏采用甘油冷冻法。首先，将经过纯化和形态及分子生物学鉴定的酵母菌菌株从斜面接种到YEPD固体平板活化，然后挑取单菌落接种至YEPD液体培养基中培养至对数生长期，将菌液与50%的无菌甘油以1∶1（体积比）混合于2 mL无菌甘油冻存管中，最后置于-80℃超低温冰箱中保藏。

2结果与分析

2.1酵母菌的分离纯化及形态学初步鉴定

本实验以太行山区野生葡萄为材料，经过对葡萄表皮酵母菌株的分离纯化，并在WL培养基上通过表型比较，共得到6株代表菌株，分别编号为W1、W2、W3、W4、W5和W6；通过WL培养基和麦氏培养基对其一系列形态特征的观察与描述结果，见图1和表1。

从图1可知，6株供试菌株呈现出5种不同的菌落形态，其中W4和W6菌落形态一致，可以推测2株菌可能属于同一个酵母菌种群；其余4株菌呈现不同的菌落形态，区别明显。

从表1可知，对于液体培养特征，W1、W4、W5和W6在液体培养中都形成膜璞，但是W1和W6形成的膜璞较弱，而W4和W5则形成较强的膜璞；W2和W3则没有膜璞的产生。对于菌株的细胞形态特征，有圆形、圆形椭圆、椭圆棒状和柠檬形4种；而就麦氏培养基上产子囊孢子的观察结果，6株菌都可以产生子囊孢子，但是W1—W3子囊孢子产量较少，而W4—W6则产生较多的子囊孢子。通过以上结果，可以初步把6株酵母菌归为5个不同的种群，其中W4和W6属于同一个种群。

图1　　代表性酵母菌株在WL培养基上菌落特征（左）及显微形态（右）

表1　代表性酵母菌株的形态特征

2.2 26S rDNAD1/D2区系统发育分析结果

对6株代表性酵母菌的26S rDNA D1/D2区域进行测序，所得的序列通过BLAST搜索比对得出与它们关系最近的参比酵母菌株的相关序列及常见酵母菌的相关序列，通过Mega 6进行序列比对并构建NJ树，见图2。由图2可知，分离得到的6株酵母菌分别与来自4个不同酵母菌属的已知菌株聚群。其中W1与Hanseniaspora（汉逊酵母属）的菌株聚为一群，并且与菌株Hanseniaspora uvarum JJZ3（NCBI登录号：JQ678681）相似性为100%，由此可以判定W1属于种群Hanseniaspora uvarum；W2 和W3都与来自Metschnikowia（梅奇酵母属）的菌株聚为一种群，但是W2与菌株Metschnikowia pulcherrima D77 2（HM627131）聚为一个分支，相似性为99.7%，而W3则与菌株Metschnikowia fructicola（KP171590）聚为一个分支，相似性为99.5%，由此判定W2和W3分别属于已知酵母种群Metschnikowia pulcherrima和Metschnikowia fructicola；W4和W6共同与Debaryomyces（德巴利氏酵母属）的菌株Debaryomyces hansenii YE-10（JQ771740）和Debaryomyces hansenii CCFEE 5619（JX124721）聚为同一种群，相似性为100%，由此断定W4和W6属于已知种群Debaryomyces hansenii；W5则与Pichia（毕赤酵母属）的菌株聚为同一种群，其中与Pichia fermentans YS118 （AM882677）聚为一个分支，相似性为100%，由此判定W5属于已知种群Pichia fermentans。所以，供试的6个代表菌株分别归属于已知的4个不同的酵母菌属和5个不同的酵母菌种群。

3讨论与展望

对于酵母菌菌种的鉴定已经从传统的宏观和微观形态学及生理学鉴定发展到今天的分子生物学鉴定方法，这正是得益于分子生物学的飞速发展。本实验从河南辉县太行山区野生山葡萄表皮分离得到了6株酵母菌，通过形态学和分子生物学鉴定，最终确定6株酵母菌分属于Hanseniaspora、Metschnikowia、Debaryomyces和Pichia 4个酵母菌已知属，并且分别归属于Hanseniaspora uvarum（W1）、Metschnikowia pulcherrima（W2）、Metschnikowia fructicola（W3）、Debaryomyces hansenii（W4和W6）和Pichia fermentans（W5）5个已知酵母菌种群。通过与表1中的菌落形态描述比较发现，尽管W4和W6属于同一个种群，但是在液体培养基中的特征存在一定的差异，可以推测两者属于两个不同的菌株；W2和W3属于同一个属的两个不同种群，所以其形态特征也有比较显著的差异；同时，通过纵向比较发现，来自5个不同种群的菌株，它们在形态特征上也存在着明显的差异，所以，只有把传统的鉴定方法与现代分子生物学鉴定方法相结合，才可以更加全面有效和准确的对未知酵母菌菌株进行分类鉴定。

图2　　基于26S rDNAD1/D2区序列的NJ发育树分析结果

酵母菌分类学方法向着简便、快捷、高效和合理的方向发展，随着大量酵母菌26S rDNAD1/D2区序列在Genbank等核酸数据库的公开，26S rDNA D1/D2区序列分析技术目前已经广泛用于酵母菌菌株的鉴定［8-9］。王洁等［1］利用形态、生理生化特征和26S rDNAD1/D2区序列分析方法对4株腐败葡萄中的酵母菌进行了鉴定，确定4株酵母菌属于酿酒酵母属的种群Saccharomyces cerevisiae；王慧等［10］利用26S rDNA D1/D2区序列分析并结合传统形态分析方法对陕甘宁和新疆及山东等地的葡萄果粒中的酵母菌菌株进行了鉴定，最终共鉴定得到13个属26个种群，其中最占优势的4个属分别为Hanseniaspora、Candida、Pichia和Issatchenkia；郭冬琴等［11］利用形态学及26S rDNA D1/D2区序列分析方法对腐败橙汁中分离的酵母菌进行了鉴定，最终确定得到的8株菌分别属于4个已知的酵母菌种群。范佳等［12］对葡萄酒发酵液中的酵母进行菌落形态、细胞显微形态及26S rDNAD1/D2区序列分析方法，最终鉴定得到5种分子类型的酵母菌，分别为胶红酵母菌（Rhodotorula mucilaginosa）、诞沫假丝酵母菌（Candida zeylanoides）、发酵毕赤酵母菌（Pichia fermentans）、酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）和有孢圆酵母菌（Torulaspora delbrueckii）。

本实验结合传统和现代分子生物学2种鉴定方法，最终对分离自河南辉县太行山区域的野生葡萄表皮酵母菌进行鉴定，为收集、鉴定和保藏野生优质酵母菌资源奠定了基础，也为今后的研究提供了科学的参考和依据。

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中图分类号：TS262.6；TS261.1；Q93-3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0057-04

基金项目：郑州轻工业学院博士科研基金资助（2014bsjj006）；国家自然科学基金青年基金资助（31400008）。

收稿日期：2016-01-15

作者简介：张俊杰（1984-），男，博士，郑州轻工业学院特聘教授、硕士生导师，E-mail：kirka640@163.com。

DOI：10.13746/j.njkj.2016096

Isolation and Identification of Yeast Strains from Wild Grapes from Taihang Mountain in He'nan

ZHANG Junjie1，YANG Xu1，ZHANG Wenye1and LIU Chonghuai1
（1.School of Food & Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，He'nan 450002；2. Zhengzhou Fruit Tree Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，He'nan 450009，China）

Abstract：In order to obtain more quality wild yeast strains，six yeast strains（W1—W6）were isolated from the skin of wild grapes from Taihang Mountain in Henan by traditional microbial isolation method. Firstly，the six strains were primarily identified through morphology tests，then 26S rDNA D1/D2 sequences of the strains were analyzed and the phylogenetic tree was reconstructed for molecular identification. According to the morphology test，the six strains presented diversities in colony，microscopic and ascosporic morphologies，and growth characteristics in liquid medium，and they were primarily classified into five morphologic groups. 26S rDNA D1/D2 sequences analysis results indicated that the six yeast strains were distributed into four genus and five species：Hanseniaspora uvarum（W1），Metschnikowia pulcherrima（W2），Metschnikowia fructicola（W3），Debaryomyces hansenii（W4 and W6）and Pichia fermentans（W5）. And the analytic results were identical to morphological results.

Key words：microbe；wild grape；yeast；26S rDNAD1/D2；isolation and identification