含银水凝胶的制备及其用于创伤敷料的研究

张爱清，胡　庆，陈小随，秦四勇

(中南民族大学 化学与材料科学学院， 催化材料科学湖北暨国家民委-教育部共建重点实验室，武汉 430074)



含银水凝胶的制备及其用于创伤敷料的研究

张爱清，胡庆，陈小随，秦四勇

(中南民族大学 化学与材料科学学院， 催化材料科学湖北暨国家民委-教育部共建重点实验室，武汉 430074)

摘要指出了水凝胶是一类性能优良的新型创伤敷料，它具有高吸收、保湿、易更换等优点.为赋予水凝胶抗菌性能，制备和研究了含有纳米银的羧甲基壳聚糖/氧化海藻酸钠复合水凝胶.用硝酸银溶液以柠檬酸三钠为还原剂和海藻酸钠为稳定分散剂制得了纳米银胶体溶液，将不同含量的纳米银胶体溶液加至羧甲基壳聚糖水溶液和氧化海藻酸钠水溶液的混合液中，制备了含有纳米银的水凝胶.通过紫外-可见光谱法、透射电镜、抗菌和细胞毒性实验对其进行了检测.结果表明：硝酸银被还原成纳米银，纳米银颗粒的粒径约为20 nm.当水凝胶中纳米银浓度为16.67 μg/mL时，水凝胶能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长.水凝胶对细胞毒性很低.故所制备的抗菌水凝胶有望用于创伤敷料.

关键词天然高分子；纳米银；复合水凝胶；抗菌性能

水凝胶是一种三维立体、以化学键或物理交联作用形成的亲水性聚合物网络，它既有液体的运动性和流动性，又有固体的形稳性[1].水凝胶敷料能提供较佳的透气、透湿、阻隔细菌侵入以及控制和吸收渗出液等特性，使伤口处于良好细胞生长愈合环境.此外，水凝胶敷料能紧密贴附于伤口处，在更换敷料时不会沾黏伤口造成二次伤害，被广泛应用于医用领域[2-4].

羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖经羧甲基化反应后的水溶性衍生物，羧基的引入大大改善了壳聚糖的水溶性，还使其成为一种既含有氨基又含有羧基的两性高分子电解质；海藻酸钠经高碘酸钠氧化制得的氧化海藻酸钠(OSA)具有双醛基结构，可作为交联剂[5]，两者经共混又可使氨基与醛基发生希夫碱反应形成化学交联[6].纳米银作为无机抗菌材料，由于其原子排列表现介于固体和分子之间的“介态”，表现出量子效应、小尺寸效应和极大的比表面积，具有其他载银无机抗菌材料无法比拟的抗菌活性，能有效地杀灭细菌、真菌、支原体等致病微生物[7-9].

本文以羧甲基壳聚糖/氧化海藻酸钠为基材，制备了含有纳米银的水凝胶，通过紫外可见光谱(UV-Vis)法和透射电镜(TEM)研究了水凝胶中纳米银结构，并研究了水凝胶对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用及对小鼠成纤维细胞(L929)的细胞毒性.

1实验部分

1.1材料和仪器

壳聚糖(CTS, 分析纯, 上海市如吉生物科技有限公司)，海藻酸钠(SAA, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司)，硝酸银(AgNO3, 上海凌峰化学试剂有限公司)，一氯乙酸(MCA, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司)，高碘酸钠(NaIO4, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司)，柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司).

紫外可见光谱仪(UV-Vis, UV-2550型, SHIMADZU公司)，透射电镜(TEM, FEI Tecnai G2 20S-Twin型, 200 kV)，倒置显微镜系统(DMIL, Leica公司)，恒温培养箱(3111型, Thermo公司)，酶联免疫检测仪(354型, Thermo公司)，傅立叶红外光谱仪(NEXUS-470, Nicolet公司).

1.2纳米银的合成

磁力搅拌下，在180 mLAgNO3溶液(0.0157 g AgNO3溶于180 mL去离子水, 即0.01 g Ag)中加入1 g海藻酸钠，形成稳定胶体溶液后，逐滴加入20 mL柠檬酸三钠(质量分数3%)，得到浓度为50 μg /mL浅黄色纳米银胶体溶液.

1.3制备含纳米银的水凝胶

将壳聚糖均匀分散在异丙醇中，经NaOH碱化后，用一氯乙酸对壳聚糖进行羧甲基化改性，得到水溶性良好的羧甲基壳聚糖；海藻酸钠溶胀于水后，加入高碘酸钠，避光反应后得到具有双醛基结构的氧化海藻酸钠.将羧甲基壳聚糖的水溶液10 mL和氧化海藻酸钠的水溶液10 mL混合后常温自交联形成水凝胶，将不同体积的纳米银胶体溶液分别加入到水凝胶中，共混后制得含纳米银的水凝胶(见表1).

表1　水凝胶的配比

1.4FT-IR分析

羧甲基壳聚糖(CMC)，氧化海藻酸钠(OSA)和交联后的产物(CMC/OSA复合水凝胶)用傅立叶红外光谱仪进行FT-IR分析.

1.5UV-Vis分析

纳米银胶体溶液(50 μg/mL)用紫外-可见分光光度计进行UV-Vis分析，在350～700 nm范围内扫描.

1.6TEM分析

样品超声分散后，用透射电镜分析纳米银的形貌，观察纳米银的尺寸.

1.7水凝胶的抗菌性能测试

参照文献[10]进行水凝胶的抗菌性能测试：称取牛肉膏(0.5 g)、蛋白胨(1g)、NaCl(0.5g)、琼脂(2 g)溶于100 mL蒸馏水，加热融化，待溶液冷至室温时，用1.0 mol/L NaOH溶液调pH至7.2，高压灭菌约30 min.待溶液冷却形成固体培养基，分别将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌涂布在固体培养基上制得平板.将水凝胶样品用移液枪注入滤纸纸片上，于37℃恒温培养12 h，测量抑菌圈尺寸.

1.8水凝胶的细胞毒性测试

用MTT比色法进行细胞毒性测试[11]：收集对数期L929细胞，调整细胞悬液浓度，接种于96孔板，每孔加入100 μL，铺板使7901细胞调密度 1000 ～10000 /孔(孔板边缘用PBS填充).5% CO2，37℃孵育，至L929细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物， L929细胞贴壁后即可加药.5个梯度(4.63, 3.70, 2.78, 1.85,0.93 μM)，每孔200 μL，每组设3个复孔，5%CO2，37 ℃孵育24 h，倒置显微镜下观察，加入含MTT的培养液，每孔加入100 mL MTT溶液(5 mg/mL,用培养基稀释)，继续培养2～4 h，终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，置摇床上低速振荡30 s，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪处测量各孔的吸光值OD492.同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，各组细胞相对生长率RGR(%)=(实验孔OD492/对照孔OD492)×100%.

2结果与讨论

2.1纳米银的合成

在合成纳米银的合成过程中，加入了生物相容性较好的海藻酸钠作为分散保护剂，并采用剧烈搅拌.海藻酸钠在还原硝酸银并制备纳米银过程中起重要作用[12]：海藻酸钠附着在纳米银颗粒表面，阻止了纳米银发生团聚，起到了分散稳定的作用.

图1为合成纳米银反应溶液的UV-Vis谱图，在波长为422 nm处出现了一个较强的吸收峰，归属于纳米银的等离子共振吸收峰[13]，说明在柠檬酸三钠的还原作用和海藻酸钠的分散稳定作用下，硝酸银被还原成纳米银.

λ/nm图1　纳米银胶体溶液的UV-Vis图Fig.1　UV-Vis spectrum of the silver nanoparticle’s dispersion

2.2含纳米银水凝胶的制备

羧甲基壳聚糖(CMC)是壳聚糖经羧甲基化反应后的水溶性衍生物，羧基的引入一方面大大改善了壳聚糖的水溶性，另一方面使其成为一种既含有氨基又含有羧基的两性高分子电解质；海藻酸钠经高碘酸钠氧化制得的氧化海藻酸钠(OSA)具有双醛基结构，可作为交联剂，两者经共混能使氨基与醛基发生希夫碱反应形成化学交联[6].由于壳聚糖和海藻酸钠链上有很多羟基，羟基是亲水基，以上两方面作用使交联结构伸展，在常温下自交联形成水凝胶.

制备所得的水凝胶具有与常见水凝胶类似的三维网状结构，该水凝胶的溶胀性能取决于羧甲基壳聚糖和氧化海藻酸钠的交联结构的伸展程度，越容易伸展水凝胶的溶胀率越高，室温下在蒸馏水中约40 min后，水凝胶的溶胀率基本达到恒定值，溶胀率约为500%.该水凝胶的机械性能较差，用力挤压可将水凝胶压碎，故用作创伤敷料时需用医用胶带固定.以羧甲基壳聚糖/氧化海藻酸钠为基材所制备得一系列含纳米银的水凝胶见如图2(图2a为水凝胶照片，图2b为纳米银溶液照片).

图2　水凝胶及纳米银溶液照片Fig.2　The photos of hydrogels and sliver nanoparticles

2.3水凝胶基材的红外分析

CMC的FT-IR结果(见图3)中，3420 cm-1处强而宽的吸收峰归属于-OH与-NH的伸缩振动吸收，2940 cm-1与2880 cm-1处归属于-CH2中-C-H的不对称与对称伸缩振动；1600 cm-1与1420 cm-1处分别属于COO-不对称与对称伸缩振动；1075 cm-1处归属于-C-O-C的伸缩振动.OSA的FT-IR图中，1735 cm-1处出现了新的吸收峰，归属于-C=O的伸缩振动峰，证明醛基的生成；水凝胶的FT-IR图中，1650 cm-1处出现了新的吸收峰，归属于-C=N的伸缩振动，表明羧甲基壳聚糖与含双醛基的氧化海藻酸钠之间产生了交联，有希夫碱生成.同时，3420 cm-1处-OH与-NH的伸缩振动吸收峰分裂为两个峰3450 cm-1与3410 cm-1，进一步说明一部分氨基与双醛基发生了交联反应.

图3 羧甲基壳聚糖、氧化海藻酸钠及水凝胶的红外谱图分析Fig.3　FT-IR pattern of CMC、OSA and hydrogel

2.4水凝胶中纳米银的形貌分析

通过TEM方法对溶胶状态下的纳米银胶体溶液的形貌进行了分析，结果如图4所示，纳米银颗粒因稳定剂海藻酸钠的保护下分散良好，无团聚现象.纳米银颗粒为实心球体，纳米银的粒径约为20 nm.

图4　纳米银胶体溶液的TEM图Fig.4　TEM pattern of the n-Ag colloidal solution

2.5水凝胶的抗菌性能测试

对水凝胶的抗菌性能进行了测试，结果如图5所示，抑菌圈尺寸列于表2.由图5可见，抑菌圈直径随水凝胶中纳米银含量的增加而增大，抑菌圈直径的大小决定了水凝胶抗菌性能的强弱，随着水凝胶中纳米银含量的增大，对大肠杆菌(Escherichiacoli)的抑制作用和对金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的抑制作用均越来越强，在纳米银浓度为16.67 μg/mL时，抑制作用均达到最大值，水凝胶对金黄色葡萄球菌生长的抑制作用高于大肠杆菌[14].故该抗菌水凝胶在皮肤抗菌治疗方面具有较好的应用前景.

图5　水凝胶抑菌照片Fig.5　The antibacterial photos of hydrogels

水凝胶抑菌圈尺寸/cm大肠杆菌金黄色葡萄球菌①0.720.93②0.791.02③0.851.11④0.881.17⑤0.911.20

注： 表2中①～⑤与表1中相对应

2.6水凝胶的细胞毒性分析

对含纳米银的水凝胶的细胞毒性进行测试，结果如图6所示，由于重金属Ag的存在，纳米银胶体溶液对L929细胞伤害极大，细胞的相对生长率(RGR)较低，在30%以下，最低只有7%[15]；而以羧甲基壳聚糖/氧化海藻酸钠为基材的水凝胶包裹纳米银胶体溶液后形成的三元复合水凝胶的细胞毒性很低，细胞的相对生长率(RGR)达85%以上.由表3可知，与表2相对应的5种含银水凝胶的细胞毒性评级在0级和1级.故该抗菌水凝胶对动物细胞无毒副作用，可作为创伤敷料直接与皮肤接触.

图6　纳米银胶体溶液及含银水凝胶的细胞毒性曲线Fig.6　The cytotoxicity curves of n-Ag colloidal solution and silver-doped hydrogel

水凝胶细胞毒性分析RGR/%细胞毒性评级①104.190②102.320③98.781④93.151⑤86.711

注： 表3中①～⑤与表1中相对应

3结语

以羧甲基壳聚糖与氧化海藻酸钠的希夫碱交联产物为基材，制备出了一系列含有纳米银的抗菌水凝胶.UV-Vis分析结果表明：在柠檬酸三钠的还原作用和海藻酸钠的分散稳定作用下，硝酸银被还原成纳米银.透射电镜测试结果证实了纳米银粒子的存在，并能直观看到它以实心球体的形式分散，尺寸约为20 nm.水凝胶能有效抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，对动物正常细胞(L929)无毒性作用，故该抗菌水凝胶在皮肤外用治疗方面具有良好的应用前景.

参考文献

[1]Hamidi M , Azadi A , Rafiei P. Hydrogel nanoparticles in drug delivery. Adv Drug Deliv Rev [J]. Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60(15):1638-1649.

[2]葛小静, 章宏伟, 史京萍, 等. 藻酸盐银联合水凝胶敷料对慢性创面愈合的作用[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2012, 16(3):539-542.

[3]Di Z, Wei Z, Bing W, et al. Carboxyl-modified poly(vinyl alcohol)-crosslinked chitosan hydrogel films for potential wound dressing [J]. Carbohyd Polym, 2015, 125:189-199.

[4]Kamoun E A , Chen X , Eldin M S M , et al . Crosslinked poly(vinyl alcohol) hydrogels for wound dressing applications: A review of remarkably blended polymers [J]. Arab J Chem, 2015, 8(1):1-14.

[5]樊李红, 潘晓然, 周月,等．羟丙基壳聚糖/氧化海藻酸钠水凝胶的制备及表征[J]. 武汉大学学报(理学版), 2010, 56(5): 501-506.

[6]吴根, 罗人明, 容彦华. 香草醛改性壳聚糖制备的研究[J]. 河北科技大学学报, 2000, 21(2): 73-77.

[7]Sheehy K, Casey A, Murphy A ,et al. Antimicrobial properties of nano-silver: A cautionary approach to ionic interference[J]. J Colloid Interf Sci, 2015, 443c: 56-64.

[8]Bankura K P, Maity D, Mollick M M R, et al. Synthesis, characterization and antimicrobial activity of dextran stabilized silver nanoparticles in aqueous medium[J]. Carbohyd Polym, 2012, 89(4):1159-1165.

[9]Nazeruddin G M, Prasad N R, Prasad S R, et al.Coriandrumsativumseed extract assisted in situ green synthesis of silver nanoparticle and its anti-microbial activity[J]. Ind Crop Prod, 2014, 60(1):212-216.

[10]钟芳芳，李云芳，陈玉，等．虎杖中大黄素的分离及抗菌活性的初步研究[J].中南民族大学学报(自然科学版)，2006，25(1)：40-42．

[11]袁琳，宁丹，唐曦阳，等．MTT法检测金黄色葡萄球菌数的研究[J]. 中南民族大学学报(自然科学版)，2014，32(2)：54-56,84．

[12]He R, Qian X, Yin J, et al. Formation of silver dendrites under microwave irradiation [J]. Chem Phys Lett, 2003, 369(3):454-458.

[13]樊新, 黄可龙, 刘素琴, 等. 化学还原法制备纳米银粒子及其表征[J]. 功能材料, 2007, 38(6):996-999,1002.

[14]陈美婉, 吴红梅, 刘长秀, 等.不同纳米银制剂抑菌作用的实验研究[J].中国消毒学杂志, 2009, 26(2):132-134.

[15]李新平, 李胜利, 张淼涛, 等. 纳米银抗菌活性和细胞毒性评价[J]. 稀有金属材料与工程, 2011, 40(2):209-214.

Preparation of Silver-Doped Hydrogel and Its Potential Application for Wound Dressing

ZhangAiqing,HuQing,ChenXiaosui,QinSiyong

(Key Laboratory of Catalysis and Materials Science of the State Ethnic Affair Commission & Ministry of Education,College of Chemistry and Material Science,South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074,China)

AbstractHydrogel as a new type of wound dressing has many merits such as high absorption, moisture retention and ease of replacement. In this work, nano-silver doped carboxymethyl chitosan/oxidized alginate composite hydrogel with antibacterial property was prepared. The silver nanoparticles were synthesized by reacting silver nitrate with sodium citrate and using sodium alginate as a dispersion aid. The composite hydrogel was then prepared in the carboxymethyl chitosan and oxidized alginate mixture solution by adding the dispersion of silver nanoparticles. UV-vis and TEM analysis indicated that the silver nanoparticles were successfully synthesized, with a particle size of about 20 nm. The hydrogels exhibited excellent antibacterial properties toEscherichiacoliandStaphylococcusaureuswith the content of silver nanoparticles of 16.67 μg/ml. Furthermore, the cytotoxicity of the hydrogels was low, suggesting that this hydrogels may be used for the treatment of wounded skin and skin disease.

Keywordsnatural polymer ; nano-silver ; composite hydrogel ; antibacterial properties

收稿日期2015-09-14

作者简介张爱清(1963-)，男，教授，博士，研究方向：功能高分子材料，E-mail：aiqingzhang_2000@sina.com

基金项目国家自然科学基金资助项目(GZY13012)；中央高校科研基本业务费资助项目(CZW15096)

中图分类号TQ317

文献标识码A

文章编号1672-4321(2016)02-0006-04