功能化氧化石墨烯载药控释性能的研究现状

钱文昊，苏俭生

（1.同济大学口腔医学院口腔修复教研室，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，上海200072；2.上海市徐汇区牙病防治所，上海200032）



功能化氧化石墨烯载药控释性能的研究现状

钱文昊1,2，苏俭生1

（1.同济大学口腔医学院口腔修复教研室，上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，上海200072；2.上海市徐汇区牙病防治所，上海200032）

摘要：氧化石墨烯载药应用于医学的预防和治疗领域是目前研究的热点。综述了近年来氧化石墨烯及其衍生物作为药物载体在控释性能及其生物安全性方面的最新研究。证实了氧化石墨烯兼具被动靶向及大量可接入活性基团的优点，是发展靶向纳米药物传输的理想载体。

关键词：氧化石墨烯；载药；控释

0　引言

药物在体内的分布主要依赖于载体的理化性质，较少依赖于药物的性质。理想的靶向传输系统不仅能够选择性地将药物输送到病变部位，并能使药物在靶组织滞留、发挥药效，防止正常组织产生不良反应。开发低毒、高效的药物载体是靶向制剂研究的核心，成功的靶向制剂载体应具备定位浓集、控制释药以及无毒可生物清除3个要素。自从2004年英国曼彻斯特大学Geim和Novoselov研究组发现由碳原子以sp2杂化连接的单层石墨烯（graphene）以来［1］，已经有大量的研究表明，功能化的纳米氧化石墨烯（Nano Graphene Oxide，NGO）是一类具有广泛应用前景的药物载体。

1　NGO是发展靶向药物传递的潜在理想载体

NGO是通过化学方法剧烈地氧化天然石墨而得到的，结构与石墨烯基本相同，只是在由碳原子构成的二维空间无限延伸的平面上连接有—OH、—COOH、—O—、C==O等含氧官能团，如图1所示。这些功能性基团赋予氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）新的特性，如分散性、亲水性等，同时有利于化学功能化修饰接枝不同的化合物（或共价负载药物），在生物医学领域表现出极大的应用潜力［2］。此外，NGO不仅可以借鉴碳纳米管已经建立的表面化学方法，快速地发展自己的功能化修饰和标记方法，而且具有较强的增强渗透与停留（Enhanced Permeability and Retention，EPR）效应和肿瘤被动靶向性［3］；sp2杂化碳原子使其具有高比表面积和大π共轭结构，其两面都可通过共价、非共价作用与药物结合，因此拥有超高的药物负荷量；再者，其制备容易、成本低［4］。所以，NGO具有多重突出的性质，是发展靶向药物传递潜在的理想纳米载体材料。

图1　氧化石墨烯的结构Fig.1 Chemical structure of graphene oxide

目前，已有很多GO应用于纳米药物传输载体的相关研究报道［5-13］，代表性的工作有2008年戴宏杰课题组首次利用PEG修饰的氧化石墨烯作为难溶性含芳香结构的抗癌药物SN38（喜树碱衍生物）的载体研究，并证实了NGO-PEG作为药物载体具有良好的生物安全性［14］。陈永胜等［15］研究了阿霉素（Doxorubicin，DOX）通过π-π堆积作用在NGO上高效负载及可控释放，并发现NGO对药物的负载可以达到238%，远远超过普通的载药材料。Zhang等［16］首先报道了将氧化石墨烯用于多种抗癌药的混合转运，以减少肿瘤的耐药性，结果发现DOX载药率可以达到400%，然而另外一种药物喜树碱（Camptothecin，CPT）的载药率较低。但是，当前的NGO体系主要是通过非共价物理吸附来载药的，载药量不稳定，载体的载药稳定性更是值得商榷。而在肿瘤被动靶向性基础上，若增加主动靶向将会提高临床实用性。有研究显示，叶酸受体在多种肿瘤细胞表面高度表达，叶酸具有肿瘤特异主动靶向能力，能够大大提高纳米材料的肿瘤靶向性［17］。因此，用叶酸对NGO进行生物靶向基团修饰，在双重靶向能力（被动和主动靶向性）的协同作用下，将具有更强的肿瘤靶向性。

2　NGO作为药物载体具有特殊优势

Yun等［18］通过改变连接碳链的长度，合成了一系列不同的银纳米粒子修饰石墨烯的复合材料，银纳米粒子具有最小的粒径，且能均匀负载在石墨烯片层表面上。抗菌试验结果表明，对鼠伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌，GO-C2-Ag比GO-C0-Ag和GO-C4-Ag表现出更强的抗菌性能。Li等［19］设计出一种简便合成胍基聚合物（polyhexamethylene guanidine hydrochloride，PHGC）和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）共修饰GO（GO-PEGPHGC）的新方法。同GO、GO-PEG和GO-PHGC相比，GO-PEG-PHGC具有更好的抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌效果。Huang等［20］通过在聚乳酸中添加一定质量分数的负载氧化锌纳米粒子制备出一种新型纳米复合材料薄膜。该薄膜具有较强的机械强度以及很好的抗紫外和抗菌性能，在光照条件下该薄膜具有高达97%以上的抗菌率。Chen等［21］通过简便的十六烷基三甲基溴化铵辅助的水热合成法，合成出一种钨酸铋（bismuth tungstate，Bi2WO6）与GO的层状纳米复合材料（BWO/GO）。该复合材料除了具有较强的吸附能力和较高的光催化性能外，还表现出在可见光照射的条件下极好的抗菌效果。Zhang等［22］通过原位同时还原GO和银离子一步法制备出银纳米粒子修饰的石墨烯片层，再通过热驱动自组装得到石墨烯/银纳米粒子杂化材料薄膜（RGO/AgNP hybrid film）。该薄膜具有很高的抗菌活性和很高的生物相容性。该杂化材料可很好地使银纳米粒子得到充分均匀的分散，大大提高了银纳米粒子同细菌接触的有效面积，从而提高其抗菌能力。Qi等［23］则将还原氧化石墨烯（reduced Graphene Oxide，rGO）与硼掺杂金刚石（Boron-Doped Diamond，BDD）阳极一同用于三电极电化学氧化体系，产生了很好的协同抗菌效果。

He等［24］研究发现GO对引起牙科疾病的病原体有很好的杀灭效果，选取变形链球菌、具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌为研究对象，使用GO的水溶液对其进行一定时间的处理，结果表明当GO浓度提高时，其杀菌效果也随之显著提高；GO纳米片层能够有效地破坏细菌的细胞壁和细胞膜，使细胞质外泄，从而起到杀灭病原体的作用。Khans等［25］将近红外激光热疗与GO相结合，发现其协同抗菌效果好于单独的近红外激光热疗和单独的GO。

文献［26］于1986年首次报道，67Ga相对分子质量约90000的铁转运蛋白在实体肿瘤组织具有被动富集的EPR效应。研究表明，肿瘤细胞属于无序生长，肿瘤组织内部非常致密，压力也随着深度越来越大。因此，一般的药物传输系统只能在肿瘤表面起作用，很难深入肿瘤组织内部产生疗效，而特定尺度（50～200 nm）的脂质体、高分子材料、纳米粒子对肿瘤组织具有EPR效应，可渗入到肿瘤组织的内部并聚集，具有被动靶向性，这一原则也被作为高分子和纳米药物制剂研制的首要准则［27］，如图2所示。NGO具有石墨烯的特有性质，如单个原子厚度、大型二维平面结构，稳定、可控制的载体尺寸（50～200 nm），具有较强的EPR效应和肿瘤被动靶向性［20］。

EPR效应实现了化疗药物肿瘤组织的被动靶向运输，这并不等于将提高治疗效果［28］，要正确地运用NGO这一有利的载体性能来提高化疗药物的治疗效果，还必须充分利用肿瘤组织和细胞微环境的特性，选择性地释放治疗化合物。靶向制剂通过EPR效应实现化疗药物肿瘤组织的被动靶向运输，随后小分子化合物如何释放并发挥生物学效应是制剂研发过程中的一大难题［29］。有研究采用化合物与纳米载体非共价吸附，载体实验显示载体在肿瘤组织有明确的EPR富集，而它们携带的［3H］紫杉醇在到达病灶之前已释放殆尽［30］；另一种情况是药物被紧密地包封于胶束，或通过酰胺键、酯键等不易释放的共价键连接到载体上，制剂虽然实现了靶向传输，但是药效大减或根本无药效，例如Doxil®［29］。因此，人们一直在探求新型的既能保证药物在体内循环过程中不释放，又能在进入病灶部位后方便地释放出药物，同时不能改变药物结构的载药方式。

图2　纳米载体肿瘤组织的被动靶向（EPR效应）和主动靶向Fig.2 The passive targeting（EPR effect）and active targeting of nano carriers tumor tissue

二硫键在谷胱甘肽（glutathione，GSH）或其他硫醇化合物的作用下会发生断键反应，而谷胱甘肽在肿瘤细胞内的浓度（2～8 mmol/L）要比其在血浆中的浓度（1～2µmol/L）高1 000倍以上，因此二硫键在体内血液循环过程中可长期稳定存在，进入肿瘤细胞后才发生断键反应。载体通过二硫键共价负载药物，则可实现药物在体内循环过程中不释放，进入肿瘤细胞后才释放出药物。例如，Ojima等［30］将肿瘤靶向分子（单克隆抗体或维生素H）与紫杉醇通过二硫键相连接，发现其在体内循环过程中可以稳定存在，在谷胱甘肽的作用下才释放出药物紫杉醇。通过设计二硫键的连接方式，断键的时候发生环化反应生成硫代内酯，断裂酯键，可以使释放出的药物保持原有结构［31］，如图3所示。

目前通过二硫键共价负载药物的研究尚处于起步阶段，可用的载体相对较少，主要是由于二硫键载药方式对载体有较高的要求，载体不仅需要具有良好的生物相容性，还需要具有大量的活性基团来提供二硫键的接入位置，同时这些活性基团反应后又不能影响载药体系的亲水性（这些活性基团如氨基、羧基等大多是提供载体亲水性的基团）［32］。优化后的PEG功能化的NGO用作二硫键共价负载药物的载体具有诱人的应用前景。

图3　释放出的药物保持原有结构不变Fig.3 The release of the drug to maintain the original structure unchanged

3　石墨烯及其衍生物还需提高其生物相容性和安全性

近年来，石墨烯及其衍生物在生物医学方向的研究有井喷式的增加，主要包括生物成像、纳米载药及光动力疗法3个方面［33］，都是利用功能化的GO作为靶向制剂载体在病灶位置的浓集效应，提高携带的分子影像探针（荧光或放射性分子标记物）、化疗药物、光敏剂等在病变组织成像或治疗效果。作为潜在医药载体的石墨烯及其衍生物应用于临床，生物安全研究十分关键［34］。目前在细胞水平已经有大量的实验，包括细菌、不同类型人源细胞系（肺上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、神经细胞等）均在不同水平对其细胞毒性进行评价。研究结果显示，GO可能通过破坏细胞质膜、诱导凋亡等方式对细胞生长表现出了明显的抑制作用。但是，几乎所有的研究都表明，表面被聚乙二醇、壳聚糖、透明质酸等多聚物修饰、功能化的GO几乎没有细胞毒性。石墨烯及其衍生物在体内的分布与毒性研究与细胞毒性分析得到了相似的结果。用188Re标记无修饰的NGO经静脉给药，会在肺部组织长时间地滞留［35］，引起炎症反应［36］；但是如在其表面进行功能化（PEG、Dextran或羧基化等）则会大大提高生物相容性，几乎可以消除石墨烯在体内的副作用［37-38］。例如，Yang等［37］的研究结果表明：聚乙二醇修饰的GO在生理环境中的稳定性很好，静脉注射后对实验小鼠无明显副作用，其在网状内皮系统的蓄积减少，几乎没有肺组织的浓集，在无靶肽段存在的情况下，肿瘤被动靶向效果明显增加；用125I标记NGO-PEG 和NGO-DEX静脉给药后起初在肝、肾等器官短暂蓄积，随后逐渐经尿和大便排泄。这也为NGO功能化修饰的必要性、细胞和体内生物的安全性提供了依据。

4　总结和展望

从2004年发现石墨烯迄今，其在科研与实际应用中的价值已充分展现。然而许多基础科学问题尚未解决，严重阻碍了GO实际应用的步伐。目前，主要存在两方面的问题使其无法面市：首先，人们对于NGO生物安全性的认识还不够深入，虽然近期已有了一些积极肯定的结果，但是NGO功能化修饰与生物系统的关系、生物清除的机理还不完全明了；其次，控制释药的关键理论和技术还不成熟。现有的研究均主要集中在NGO的功能化及非共价的药物载体携带上，虽然功能化NGO有非常高的吸附能力，但作为一种开放型的二维晶格结构，相较脂质体药物载体具有稳定、可控的包封率（包封率通常＞80%）。由于NGO的物理吸附载药体系稳定性差，特别是水溶性药物在体内的载体性能更加不稳定，所以当前的关键是完善功能化NGO药物载体共价载药理论，阐明载药体系的释药行为和载体的生物清除规律。

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A Review on Functional Graphene Oxide Property of Drug Delivery

QIAN Wenhao1,2，SU Jiansheng1
（1.Department of Prosthodontics，School of Stomatology，Tongji University，Shanghai Engineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration，Shanghai 200072，P.R.China；2.Department of Stomatology，Shanghai Xuhui District Dental Center，Shanghai 200032，P.R.China）

Abstract：The prevention and treatment of graphene oxide drug delivery used in medicine is a hot topic at present.This paper reviews the graphene oxide and its derivatives as drug carriers in controlled release properties and biological safety of the latest research.It is confirmed that the graphene oxide both advantages of passive targeting and a large number of active groups，which is an ideal carrier to the development of nano drug delivery target.

Keywords：graphene oxide（GO）；drug-loaded；controlled-release

中图分类号：R318.08

文献标志码：A

文章编号：1001-4543（2016）02-0088-06

收稿日期：2016-03-23

通信作者：苏俭生（1967—），男，福建仙游人，教授，博士，主要研究方向为口腔修复学。电子邮箱sjs@tongji.edu.cn。

基金项目：国家自然科学基金（No.81371949，No.81572114）、上海市生物医药科技重点项目（No.13411951200）资助