Drak2在高糖诱导胰岛β细胞凋亡中的作用

王广宇, 吴国亭

(1. 上海市普陀区人民医院内分泌科，上海 200060； 2. 同济大学附属第十人民医院内分泌科，上海 200072)



·基础研究·

Drak2在高糖诱导胰岛β细胞凋亡中的作用

王广宇1, 吴国亭2

(1. 上海市普陀区人民医院内分泌科，上海 200060； 2. 同济大学附属第十人民医院内分泌科，上海 200072)

目的 探讨Drak2在高糖诱导的胰岛β细胞凋亡中的作用。方法 不同浓度葡萄糖诱导刺激，模拟体外胰岛细胞糖毒性损伤后的细胞凋亡模型，通过CCK8检测葡萄糖作用后细胞的存活率；Western印迹法检测不同糖浓度时Drak2的表达情况，完成糖浓度的筛选。构建Drak2-pcDNA3.0质粒，应用基因转染技术构建Drak2过表达可诱导细胞系，Western印迹法分析糖诱导前后胰岛β细胞Drak2的表达。Real-Time PCR测定Drak2、Bax、Bcl-2的mRNA水平,流式细胞法测定诱导前后的凋亡情况。结果 CCK8结果显示，随着培养液中糖浓度上升，Rinm 5mf凋亡逐渐增加，随着时间的增加(24、48、72h)凋亡也逐渐增加，呈一定的量效关系。Western印迹法显示在糖浓度22.2mmol/L培养72h时，Drak2的表达量最多。构建Drak2过表达,在转染6h后开始葡萄糖诱导，在高糖诱导72h时过表达组Drak2蛋白是正常组的6倍。Real-Time PCR显示，过表达组Drak 2 mRNA在葡萄糖诱导前开始增加，在高糖诱导72h时增高明显(P<0.05)，凋亡相关基因BAX、Bcl-2表达均有增加(P<0.05)。流式细胞仪检测显示高糖诱导后，过表达组凋亡率明显高于正常组(P<0.05)。结论 Drak 2过表达促进高糖诱导的胰岛β细胞凋亡。

Drak2； 葡萄糖； β细胞； 凋亡

无论1型糖尿病还是2型糖尿病，诊断时β细胞已丧失50%～80%，β细胞数量减少与细胞凋亡有关，糖尿病时胰岛β细胞凋亡加速[1-2]，在糖尿病的早期由于胰岛素抵抗导致胰岛β细胞功能增强，胰岛细胞的负荷加重；随着病情的进展，胰岛β细胞的功能逐渐衰竭，主要表现为细胞功能降低和细胞数目减少，现已发现高糖、高脂和某些细胞炎性介质如TNF-α等是诱导胰岛β细胞功能衰竭的重要因素。DAP凋亡诱导激酶2(Drak2)是丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族，有研究发现Drak2在T细胞凋亡中起着相当重要的作用[3-4]，而T细胞与其他细胞的凋亡，如胰岛β细胞凋亡等有很大的共性。本研究旨在探讨Drak2在高糖诱导的β细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

Rin m5f细胞株购自美国ATCC公司,DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司，反转录试剂盒购自美国ABI公司，限制性内切酶(EcoRI、BamHI)、CIAP、T4 DNA连接酶购自日本TaKaRa公司，TOP10感受态细胞、质粒小量抽提试剂盒购自中国天根生化公司，SYBR GREEN购自美国ABI公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海西唐生物科技有限公司。

1.2 细胞培养

选用Rin m5f细胞株，采用DMEM高糖培养基，添加15%胎牛血清，1%Hepes缓冲液及1%青链双抗，于37℃含5%CO2条件下培养。

1.3 过表达质粒的构建

过表达质粒采取PC-DNA3.0载体，细胞提取RNA并反转录后，针对DRAK2全长序列设计PCR引物并加入BamHI及EcoRI酶切位点，PCR取得DRAK2基因并测序正确后，对载体及PCR产物双酶切4h，去磷酸化0.5h，纯化后连接过夜取连接产物转化TOP10感受态细胞，涂LB培养板(含AMP抗性培养基)培养过夜，挑单克隆菌落，170r/min摇菌12h，抽提质粒，测序正确后备用。

1.4 细胞转染

选择对数生长期细胞作为转染细胞。转染前1d，在不包含抗生素的培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度要达到30%～50%。对每孔细胞，用无血清培养基稀释质粒至250μl，温和混匀，室温静置5min；用无血清培养基稀释脂质体至250μl，温和混匀室温静置5min；将质粒和脂质体混合(总体积 500μl)，室温孵育 20min；将 500μl 脂质体-DNA复合物加入Rin-m5f细胞，摇动培养板，轻轻混匀；CO2培养箱中37℃培养6h，弃去无血清培养基，换成2ml完全培养基。

1.5 糖毒性筛选试验

指数生长期的细胞收集计数后，(3～4)×105/ml接种96孔板，使其葡萄糖终浓度分别为： 0、5.5、11.1、22.2、33.3、44.4和 55.5mmol/L。分别培养1、2、3d，用于细胞增殖能力检测。各孔均设3各复孔。Western印迹法检测初筛的不同葡萄糖浓度作用不同时间时Drak2蛋白的表达情况，选择一个最适的培养时间和浓度。

1.6 CCK-8实验

上述Rin-m5f细胞经不同葡萄糖作用后及后续转染后，每孔加入10μl的CCK8溶液，37℃孵育4h；使用酶标仪450nm波长测定各孔的吸光度值(D450)，计算出3个平行孔的均值。计算细胞存活率： 以不加糖的空白对照，即浓度为0孔的D450为对照，细胞存活率=实验组D450/对照组D450×100%。

1.7 Real-Time PCR检测Drak2、Bax、Bcl-2 mRNA的表达

6孔板细胞抽提RNA并反转录后，使用ABI Prism 7900HT型荧光定量PCR仪，通过SYBR GREEN法测Drak2、Bcl-2、Bax基因mRNA表达水平，以GAPDH为内参，10μl反应体系，OPN引物序列上游5′-TCTGATGAGACCGTCACTGC-3′，下游5′-ACGGAGTCTGATAGAGTAGG-3′。反应条件如下： 95℃ 5min预变性，95℃ 15s，65℃ 35s，共40个循环。

1.8 Western 印迹法检测Drak2蛋白的表达

提取总蛋白后，蛋白定量采用BCA蛋白定量法，进行蛋白变性(20μl，5×SDS-PAGE loading buffer，10μl mol/L DTT，70μl 样品，100℃沸水5min)，SDS-PAGE电泳，转膜(湿转)，封闭与抗体杂交，显影、定影。

1.9 统计学处理

SPSS 13.0软件处理数据。组间差异采用方差分析，各实验组与对照组比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 高糖对Rin-m5f细胞存活的影响

不同浓度的葡萄糖(0、5.5、11.1、22.2、33.3、44.4、55.5mmol/L)作用于Rin-m5f细胞(24、48、72h)，随着葡萄糖浓度的增加，Rin-m5f的存活率下降，提示葡萄糖可抑制Rin-m5f细胞的生长，并呈现一定的量效关系，且同一作用时间各浓度的细胞存活率与对照组(葡糖糖浓度为0mmol/L)相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 Drak2蛋白在不同糖浓度、不同时间作用下的表达情况

CCK8结果显示，Drak2蛋白表达在11.1mmol/L、22.2mmol/L、33.3mmol/L差异有统计学意义，Rin-m5f细胞分别在三者浓度作用下培养24、48、72h，结果显示Rin-m5f细胞在糖浓度为22.2mmol/L、培养72h时，Drak2蛋白表达量最大,见图1。后续诱导实验都是以此为标准。

图1 不同糖浓度作用不同时间Drak2蛋白的表达Fig.1 Expressions of Drak2 protein in different glucose concentration and different timeA: 11.1mol/L葡萄糖培养24h;B: 11.1mol/L葡萄糖培养48h;C: 33.3mol/L葡萄糖培养24h;D: 22.2mol/L葡萄糖培养24h;E: 22.2mol/L葡萄糖培养48h;F: 33.3mol/L葡萄糖培养48h；G: 11.1mol/L葡萄糖培养72h;H: 22.2mol/L葡萄糖培养72h;I: 33.3mol/L葡萄糖培养72h

2.3 转染中脂质体浓度、质粒浓度的筛选

转染时分别将质粒4、6、8、10μl稀释至250μl，脂质体分别由4、6、8、10μl稀释至250μl，6h后更换完全培养基，24h后评价转染效率，发现质粒和脂质体都为6μl时转染效率最高，而在两者浓度为10μl 时细胞存活率非常低，可能是由于脂质体浓度高，对细胞的毒性所致，见图2。

图2 转染后摄片

2.4 Real-Time PCR检测Drak2、Bax、Bcl-2 mRNA的表达

Rin-m5f细胞正常组、阴性对照组、过表达组、阳性对照组葡萄糖诱导前后Real-Time PCR检测Drak2、Bax、Bcl-2 mRNA的相对表达，计算过表达组与对照组的扩增倍数，Real-Time PCR结果显示，Drak2 mRNA在葡萄糖诱导前过表达组就开始增加，在高糖诱导72h时，增高明显(P<0.05)，凋亡相关基因Bax、Bcl-2表达均有增加(P<0.05)，见表1。

表1 葡萄糖诱导前后不同组Dark2、Bax及Bcl-2 mRNA表达

与阴性对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5 各组Drak2蛋白的表达情况

在转染6h后开始葡萄糖诱导。Western印迹法显示，各组(正常组、阴性对照组、过表达组、阳性对照组)在诱导前，Drak2蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)，见图3；在高糖诱导72h，过表达组Drak2蛋白是正常组的6倍，见图4。

图3 诱导前各组Drak2蛋白表达情况Fig.3 Drak2 protein expression in different groups before glucose induction

2.6 各组细胞早期凋亡率

流式细胞仪检测显示在22.2mmol/L葡萄糖作用下，各组细胞凋亡均增加，说明高糖可以诱导胰岛β细胞凋亡；但是各组在同样浓度葡萄糖(22.2mmo/L)作用相同的时间下(72h)，各组凋亡增加情况不同，正常组高糖诱导后，凋亡增加43%[(3.5±0.1)%vs. (5.0±0.1)%]，过表达组凋亡增加440%[(2.9±0.3)%vs. (15.9±0.4)%]，与正常组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

图4 诱导后各组Drak2蛋白表达情况Fig.4 Drak2 protein expression in different groups after glucose induction

3 讨 论

目前,全球糖尿病患者数已超过3亿,中国接近1亿[5]。无论1型还是2型糖尿病，都存在β细胞凋亡，而Drak2基因位点2q32.3,靠近糖尿病基因致病位点。有研究发现Drak2在T细胞凋亡中起重要作用，近年来，它成为很多疾病包括自身免疫性疾病的新靶点[6]，那么Drak2是否对高糖环境诱导的胰岛β细胞凋亡也有影响呢?是否能成为糖尿病的新靶点呢?

胰岛β细胞功能障碍及胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的基本环节，当β细胞不能适应环境变化分泌适量的胰岛素时，血糖就会升高，若不及时控制，高血糖最终会导致一系列的恶性循环，即“葡萄糖毒性”，引起胰岛β细胞凋亡。本研究也证实了在高糖条件下，胰岛β细胞凋亡率会增加。Rin-m5f细胞正常组在22.2mmol/L的葡萄糖作用72h时，细胞凋亡率由3.5%增加到5%，而且随着糖浓度的升高，其细胞存活率在逐渐下降，如CCK8结果所示。但是高糖引起胰岛β细胞凋亡的具体机制至今尚未完全阐明，目前主要认为高浓度的葡萄糖通过干扰β细胞线粒体内糖代谢、使β细胞膜表面潜在的自身抗原表达增加、改变Bcl蛋白家族之间的平衡等来调节胰岛β细胞凋亡水平。虽然机制并不明确，但是可以确定高糖的毒性，因此，应及早对糖尿病患者进行干预治疗，积极控制高血糖，这对保护胰岛β细胞功能，延长β细胞功能衰竭是至关重要的。

本研究证实了Drak2过表达促进了高糖诱导的胰岛β细胞的凋亡，在过表达模型组中，诱导后是诱导前的540%。而正常组，诱导后是诱导前的144%倍，过表达组凋亡增加的倍数接近正常组的400%，可见过表达Drak2可增加高糖诱导的胰岛β细胞的凋亡。这与动物研究结果相似。Drak2到底都通过何种途径和信号通路引起胰岛β凋亡，是接下来需要做的工作，探讨其机制，为糖尿病的防治提供新的思路。

[1] Marchetti P, Dotta F, Lauro D,et al. An pverview of pancreatic beta-cell defects in human type 2 diabetes: implications for treatment[J].Regul Pept,2008,146(1- 3): 4-11.

[2] Matveyenko AV, Butler PC. Beta-cell deficit due to increased apoptosis in the human islet amyloid polypeptide transgenic(HIP) rat recapitulates the metabolic defects present in type 2 diabetes[J]. Diabetes, 2006,55(7): 2106-2114.

[3] Mao J, Qiao X, Luo H, et al.Transgenic drak2 over expression in mice leads to increased T cell apoptosis and compromised memory T cell development[J]. J Biol, 2006,281: 12587-12595.

[4] Weist BM, Hernandez JB, Walsh CM. Loss of DRAK2 signaling enhances allogeneic transplant survival by limiting effector and memory T cell responses[J]. Am J Transplant, 2012,12(8): 2220-2227.

[5] 顾玉春,王清秀.糖尿病神经病变患者行蛛网膜下腔阻滞麻醉的研究进展[J].同济大学学报: 医学版2015,35(1): 120-124.

[6] Leonczak P, Ling-jie Gao, Ramadori AT,et al.Synthesis and structure-activity realtionship studies of 2(1,3,4-Oxadiazole-2(3H)-thione)-3-amino-5-arylthieno(2,3-b) pyridines as inhibitors of DRAK2[J]. Chem Med Chem,2014,9: 2087-2601.

Effects of Drak2 on apoptosis of pancreatic beta cells induced by high glucose

WANGGuang-yu1,WUGuo-ting2

(1. Dept. of Endocrinology, People’s Hospital of Putuo District, Shanghai 200060, China; 2. Dept. of Endocrinology, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China)

Objective To investigate the effect of Drak2 on apoptosis of pancreatic betacells induced by high glucose. Methods Murine Rin-m5f pancreatic β-cells were culturedinvitroand the cell apoptosis model was established by high glucose. Cell viability was detected by CCK8 method. The expression of Drak2 was analyzed by Western blotting. Drak2-pcDNA3.0 was transfected in Rin-m5f cells to establish stable Drak2-overexpressing cells. The expression of Drak2 induced by glucose in the both cell lines was confirmed by immunofluorescence staining. Drak2 mRNA, Bax mRNA, Bcl-2 mRNA were quantitated by Real-Time PCR. The apoptosis was deterrmined by flow cytometry. Results The viability of Rin-m5f cells was significantly reduced in a dose-dependent manner after exposure to glucose at the range of 0-55.5 mmol/L for 24, 48 and 72 h; the expression of Drak2 was the highest when cells were cultured with glucose at 22.2 mmol/L for 72h. With glucose, the expression of Drak2 in over-expression cells was six times of the control cells as measured by Western blotting. Drak2 mRNA was increased before induction, which was highly significant after 72 h in over-expression group(P<0.05). From flow cytometric assay, the percent of apoptosis in over-expression group was highly significant, compared to the control group (P<0.05).Conclusion Drak2 overexpression results in increased β-cell apoptosis induced by glucose stimulation.

Drak2； glucose； β cell； apoptosis

10.16118/j.1008-0392.2016.02.005

2015-11-29

上海市科委科技攻关重大项目(04DZ19507)

王广宇(1985—)，女，住院医师，硕士研究生.E-mail: wo198501@163.com

吴国亭.E-mail: WGT1212@hotmail.com

R 589.1

A

1008-0392(2016)02-0019-05