E26转录因子和VEGF在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义

顾丹萍， 冯晓丹， 王建军

(1. 同济大学医学院，上海 200092； 2. 上海市浦东新区浦南医院妇产科，上海 200125； 3. 同济大学附属同济医院妇产科，上海 200065)



·基础研究·

E26转录因子和VEGF在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义

顾丹萍1， 冯晓丹2， 王建军3

(1. 同济大学医学院，上海 200092； 2. 上海市浦东新区浦南医院妇产科，上海 200125； 3. 同济大学附属同济医院妇产科，上海 200065)

目的 探讨E26转录因子(E26 transformation specific-1, Ets-1)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法 在55例卵巢上皮性肿瘤以及12例正常卵巢组织中，采用免疫组化SP法检测其中Ets-1及VEGF蛋白的表达；原位杂交法检测组织中Ets-1mRNA的表达。结果 Ets-1及VEGF在卵巢上皮性癌中的表达显著高于正常、良性及交界组(P<0.01)。FIGO Ⅲ-Ⅳ期组中Ets-1以及VEGF蛋白的表达均高于FIGO Ⅰ-Ⅱ早期组(P<0.05)；肿瘤细胞低分化组中Ets-1的表达明显高于中高分化组(P<0.01)；有淋巴结转移组中两者表达高于无淋巴结转移组(P<0.05)；Ets-1蛋白和m RNA的表达显著相关(rs为0.609，P<0.01)；肿瘤组织中Ets-1和VEGF的表达密切相关(rs=0.288，P<0.05)。结论 Ets-1和VEGF是卵巢上皮性肿瘤中重要的促血管生成因子，与肿瘤的发展转移及患者的预后关系密切。

E26转录因子； 血管内皮生长因子； 卵巢上皮性肿瘤； 原位杂交； 免疫组织化学

肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管形成。近年来，作为肿瘤组织血管生成的重要因子，E26转录因子(E26 transformation specific-1， Ets-1)受到人们越来越多的关注。在卵巢肿瘤中，上皮来源的肿瘤约占原发性卵巢肿瘤的50%～70%，其中，浆液性肿瘤是最为常见的一种[1]。本研究以卵巢上皮浆液性肿瘤为研究对象，探讨Ets-1和VEGF在卵巢肿瘤主要是上皮性肿瘤的血管生成、发展和转移中的作用及临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取2011年1月至2015年1月上海市浦东新区浦南医院病理科55例卵巢上皮浆液性肿瘤手术切除的石蜡标本，其中包括浆液性囊腺癌34例，交界性浆液性囊腺瘤8例，浆液性囊腺瘤13例。根据FIGO标准临床分期，浆液性囊腺癌34例中包括早期14例(Ⅰ～Ⅱ期)，晚期20例(Ⅲ～Ⅳ期)；盆腔淋巴结转移阳性者23例，阴性11例；WHO分级高分化7例，中分化9例，低分化18例。在所有病例中，均有明确的病理组织学诊断、以及完整的临床资料。所选蜡块均复查H-E切片无误。另取12例癌旁正常组织为对照。55例肿瘤患者中，其年龄分布为17～77岁，平均年龄(45±14.9)岁；正常对照组中，其年龄分布22～69岁，平均年龄(45±13.5)岁，其组间差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂

鼠抗人Ets-1多克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体、SP试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司。原位杂交用寡核苷酸探针由北京奥科生物技术有限公司合成，原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司。

1.3 方法

所有标本经固定包埋制成蜡块后连续 4～6μm切片，粘贴于0.1%多聚赖氨酸处理过的玻片上，采用免疫组化SP法检测Ets-1和VEGF蛋白的表达，原位杂交法检测Ets-1m RNA的表达。鼠抗人Ets-1多克隆抗体浓度1∶400、鼠抗人VEGF单克隆抗体1∶100，以PBS液代替一抗作空白对照，已知的阳性片作为阳性对照，免疫组化SP法操作按照试剂盒步骤进行。原位杂交用寡核苷酸探针遵守分子杂交原则设计合成，并在5′端标记生物素，其序列如下： 5′-CGTCTTGATGATGGT-GAGAGTCGGCTTGAG-3′。阴性对照使用正义探针，即与探针序列互补的mRNA序列，和省去探针的杂交液；阳性对照使用已知的阳性片子。杂交前预处理、预杂交、杂交后处理以及显色按照试剂盒步骤进行。

1.4 判定方法

根据每个细胞的染色强度，分为阴性、弱阳性、阳性和强阳性。弱阳性以上为阳性细胞。使用文献[2]的方法作为对肿瘤组织判定标准的参照并加以修改，即根据单个细胞的染色深浅以及阳性细胞数量进行判定。(-)： 阳性细胞数<30%；(±)： 阳性细胞数31%～60%；(+)： 阳性细胞数61%～80%；(++)： 阳性细胞数≥81%。在每例标本中，若阳性细胞率在61%以上，则认为该例为阳性表达。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件行测试数据的χ2检验和Spearman相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Ets-1和VEGF的表达及其与肿瘤临床病理特征之间的关系

Ets-1和VEGF的mRNA和蛋白的阳性颗粒主要分布在肿瘤细胞的胞浆中，阳性细胞的分布有明显的异质性，在间质血管内皮细胞的胞浆中也可有表达。

卵巢上皮性癌组织中Ets-1和VEGF的阳性表达率明显高于正常组、良性组及交界性组(P均<0.01)，而VEGF在正常组、良性组和交界性组三者中的表达差异并无统计学意义(P>0.05)，见表1。Ets-1和VEGF的表达均与FIGO分期呈负相关，其阳性表达率Ⅰ～Ⅱ期早期组低于Ⅲ～Ⅳ期组(P<0.05、P<0.01)，见表2。卵巢上皮性癌组织中细胞中、高分化组Ets-1 mRNA及蛋白的表达阳性率明显低于低分化组(P<0.01)，而中、高分化组间相比较并无显著性差异(P>0.05)，VEGF蛋白的表达则与肿瘤细胞分化程度无关(P>0.05)，见表3。上皮性癌的淋巴结转移与两者的表达密切相关，无淋巴结转移组中两者的阳性表达率低于有淋巴结转移组(P<0.01、P<0.05)，见表4。

表1 Ets-1和VEGF的表达与标本组织类型的关系

与恶性组相比，*P<0.05,**P<0.01

表2 Ets-1和VEGF的表达与临床病理分期的关系

与Ⅰ～Ⅱ期组相比，*P<0.05,**P<0.01

表3 Ets-1和VEGF的表达与细胞分化程度的关系

与低分化组相比，**P<0.01

表4 Ets-1和VEGF的表达与淋巴结转移的关系

与无淋巴结转移组相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 Ets-1mRNA和蛋白表达在不同组织类型中的相关性

在36例Ets-1mRNA阳性表达病例中，Ets-1蛋白阳性表达率为83.3%(30/36)；在31例Ets-1mRNA阴性表达病例中，Ets-1蛋白阳性表达率为22.6%(7/31)，两者差异有统计学意义(P<0.01)。Ets-1mRNA和蛋白表达显著相关(rs=0.609，P<0.01)。

2.3 Ets-1和VEGF蛋白表达在卵巢上皮浆液性肿瘤中的相关性

在37例Ets-1蛋白阳性表达的患者中，VEGF蛋白阳性表达率为78.4%(29/37)；在18例Ets-1蛋白阴性表达的患者中，VEGF蛋白阴性表达率为50.0%(9/18)，差异有统计学意义(P<0.05)。肿瘤组织中Ets-1和VEGF的表达密切相关(rs=0.288，P<0.05)。

3 讨 论

3.1 Ets-1和VEGF诱导肿瘤血管生成的机制

肿瘤血管的形成及其调节是多种因素共同作用的结果，是一个极为复杂的过程。在卵巢肿瘤中，作为卵巢肿瘤最为重要的血管生成因子，VEGF可能诱导Ets-1的表达，发挥原癌基因的作用。而Ets-1则作为血管生成的中介因素，通过其DNA结合Ets结构域，同多种血管生成相关因子(如MMPs，整合素β3等)的启动子或增强子区域中富含嘌呤的序列GGA(A/T)相结合，从而在该类基因表达调控中发挥作用，进而促进肿瘤血管的生成[3-4]。研究[5]表明，间质的微血管密度MVD值与Ets-1和VEGF蛋白表达量密切相关，这表明此二者参与了肿瘤血管生成过程。在本研究中，肿瘤组织内VEGF和Ets-1的阳性表达率明显高于癌旁组织，且两者的表达呈正相关，支持了VEGF通过诱导Ets-1基因表达促进肿瘤血管生成的观点。

3.2 Ets-1和VEGF在卵巢肿瘤发展及浸润转移中的作用和机制

恶性肿瘤的主要特点包括自主性生长和侵袭性转移，转移灶的大量形成往往是肿瘤终末期患者的死因。在侵犯正常组织的过程中，恶性肿瘤细胞一般要经历黏附、降解、穿越基底膜(ECM)等几个步骤。由于肿瘤组织中新生血管形成可以被Ets-1和VEGF所诱导，并与肿瘤侵袭过程相关的黏附分子(如整合素β3、VE-cadherin和蛋白水解酶类如u-PA、MMPs等)还可被Ets-1激活，故Ets-1有助于恶性肿瘤穿越基底膜，进而发生局部浸润和远处转移。研究[5-6]表明，Ets-1和VEGF的高表达与FIGO的较高分期、细胞低分化、淋巴结转移等密切相关，提示二者在肿瘤的发展和转移过程中起着重要的作用。本研究支持上述结论。

另外，多种肿瘤的相关研究表明，Ets-1在肿瘤组织中的表达情况是评价肿瘤细胞恶性潜能和预后的指标，Ets-1的高表达往往预示了患者预后不良，此与其促进肿瘤血管生成和肿瘤浸润转移生物学特性密切相关。血管生成对于肿瘤的生长和浸润转移是非常必须的，而随着转移灶的大量形成，患者的预后也不断恶化。研究[6]表明，肿瘤组织中Ets-1的表达水平均与微血管计数MVCs相关，且高表达Ets-1的病例24个月生存率显著低于Ets-1低表达者，提示其与预后关系密切。

3.3 Ets-1和VEGF在抗血管生成治疗肿瘤方面的意义和前景

基于Ets-1和VEGF在肿瘤血管生成和发生发展方面的重要作用，近年来，以Ets-1和VEGF为靶点的抗肿瘤治疗受到了人们的广泛关注，也取得了重大进步。作为血管通透性因子以及血管内皮细胞特异性生长因子，VEGF在抗血管新生疗法中引起了人们的极大兴趣[8]。实验证实，如果使用结构域阴性突变的Ets-1分子或反义寡核苷酸链阻断其作用，那么如MMPs，整合素β3等相应的靶分子的表达水平也会有所下降，进而使血管的生成受到抑制[9]。Khatunn等[6]发现，在VEGF和Ets-1两者共同发挥作用时，对肿瘤的抑制作用更加有效。作为主要的负性调节因子和Ets-1的特异性抑制剂，转优势突变型Ets-1(transdominant mutant Ets-1)可以抑制Ets-1的功能，并且可能成为抑制肿瘤血管生成的有效工具。

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doi： 10.16118/j.1008-0392.2016.02.004

Expression of Ets-1 and VEGF in epithelial ovarian neoplasms and its clinicopathological significance

GUDan-ping1，FENGXiao-dan2，WANGJian-jun3

(1. Medical College, Tongji University， Shanghai 200092, China; 2. Dept. of Gynecology and Obstetrics, Shanghai Punan Hospital of Pudong New Area, Shanghai 200125, China; 3. Dept. of Gynecology and Obstetrics, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To examine the expression of E26 transformation specific-1(Ets-1) and vascular endothelial growth factor(VEGF) in epithelial ovarian neoplasm, and its clinicopathological significance. Methods The expression of Ets-1 and VEGF proteins were detected by immun-ohistochemistry, and the expression of Ets-1mRNA was detected byinsituhybridization in 55 tissue samples of epithelial ovarian neoplasms and 12 samples of pericancerous ovarian tissue. Results Serous cystadenocarcinoma had higher expression of both Ets-1 and VEGF than normal ovarian tissue, serous cystadenoma and borderline serous cystadenoma(P<0.01). The expression of Ets-1 and VEGF in ovarian carcinomaⅠ-Ⅱ stage was lower than that in carcinoma Ⅲ-Ⅳ stage (P<0.05); expression of Ets-1 in low histological grade ovarian carcinoma was higher than that in middle and high histological grade carcinoma (P<0.01); the expression of Ets-1 and VEGF in ovarian carcinoma without lymph nodes metastasis was lower than that in those with metastases (P<0.05). The expression of Ets-1 mRNA was positively correlated with expression of Ets-1 and VEGF proteins (rs=0.609,rs=0.288, respectively, bothP<0.05). Conclusion The results indicate that Ets-1 and VEGF may be involved in the development and metastases of epithelial ovarian neoplasms.

E26 transformation specific-1; vascular endothelial growth factor; epithelial ovarian neoplasm;insituhybridization; immunohistochemistry

10.16118/j.1008-0392.2016.02.003

2015-12-20

顾丹萍(1975—)，女，主治医师，学士.E-mail：13501946485@163.com

王建军.E-mail： jjwang0524@sina.com

R 737.31

A

1008-0392(2016)02-0010-04