淫羊藿素对骨肉瘤细胞增殖分化及侵袭力的影响

吴庆，冯琼，刘星

(1.南昌大学第二附属医院 骨科，江西 南昌 330006；2.南昌大学护理学院，江西 南昌 330006)

淫羊藿素对骨肉瘤细胞增殖分化及侵袭力的影响

吴庆1Δ，冯琼2，刘星1

(1.南昌大学第二附属医院 骨科，江西 南昌 330006；2.南昌大学护理学院，江西 南昌 330006)

目的 研究淫羊藿素对骨肉瘤细胞增殖分化及侵袭力作用机制。方法 以骨肉瘤细胞MG-63为研究对象，分别用4、8、16、32、64 μmol/L浓度的淫羊藿素与骨肉瘤细胞MG-63细胞作用24 h、48 h、72 h，同时设置空白对照组，经MTT法检测细胞抑制情况。通过Annexin V/PI双染色淫羊藿素浓度为4、8、16、32 μmol/L作用48 h后的骨肉瘤细胞MG-63经流式细胞仪观察并计算细胞凋亡率。Transwell小室检测经淫羊藿素浓度为4、8、16、32 μmol/L作用48 h后的骨肉瘤细胞MG-63侵袭能力。Western blot检测淫羊藿素对细胞中Bax、Bcl-2、MMP-9表达影响。结果 与对照组相比，淫羊藿素作用后的骨肉瘤细胞MG-63，抑制率有显著差异(P<0.05)。骨肉瘤细胞经0、4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的细胞凋亡率依次为0.125 1±0.018 4，0.241 4±0.019 7，0.436 5±0.030 1，0.723 2±0.031 5，0.789 7±0.047，进一步说明了淫羊藿素是通过促进癌细胞凋亡抑制癌细胞增殖的。浓度为4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤MG-63细胞侵袭力与对照组相比差异显著(P<0.01)。淫羊藿素可以减弱骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力，作用浓度越大，侵袭力抑制作用越明显。淫羊藿素作用后的细胞中Bax蛋白表达随着淫羊藿素作用浓度的增加而逐渐降低。淫羊藿素作用后的细胞中Bcl-2、MMP-9蛋白表达随着淫羊藿素作用浓度的增加而逐渐降低。结论 淫羊藿素可以抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭，促进骨肉瘤细胞凋亡，抑制作用随着淫羊藿素浓度的增加而增加，促细胞凋亡作用随着作用时间和作用浓度的增加而增加，作用机制与Bax、Bcl-2、MMP-9有关。

骨肉瘤细胞；淫羊藿素；增殖抑制；凋亡

骨肉瘤(Osteosarcoma)是常见的恶性肿瘤，在原发性恶性骨肿瘤中，发病率排名第二，仅次于细胞骨髓瘤[1]。骨肉瘤致死率高，任何年龄阶段的人都有发病可能。骨肉瘤不易根治，复发率高，转移能力强，治疗后恢复能力差。常用治疗骨肉瘤的方法是手术、化疗。但手术恢复速度慢，化疗副作用较多，且价格昂贵[2]。因此，寻找新的治疗方法是目前研究的热点。

淫羊藿是一种中草药，属于小檗科淫羊藿属的一种植物。在日本,中国江西、湖南、四川等地分布较为广泛。具有补肾阳、强筋骨的功效[3]。在治疗小儿麻痹、慢性气管炎、神经衰弱中得以广泛应用，对免疫系统、心血管系统、对内分泌均有一定的药理作用。淫羊藿素(Icaritin,ICT)是淫羊藿的一种衍生物，在疾病治疗中具有很强的生物学活性[4]。研究表明[5]，淫羊藿素在乳腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌等多种癌症的体外细胞实验中具有抑制癌细胞增殖分化的作用。为了明确淫羊藿素对骨肉瘤细胞的作用，本研究以骨肉瘤细胞MG-63为研究对象，探究淫羊藿素对骨肉瘤细胞的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人骨肉瘤细胞MG-63由中南大学湘雅医院细胞中心提供。

1.1.2 仪器：Wallace 1420酶标仪购自南京德铁实验设备有限公司；TC2323 CO2培养箱购自日本SANYO；SW-CJ-IF超净工作台购自苏州净化设备有限公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD；CSX41倒置显微镜购自日本尼康。

1.1.3 试剂：Matrigel、RPMI1640、青链霉素、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma；PBS、Annexin V和PI购自鼎国生物试剂有限公司；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青有限公司；MTT购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：-80 ℃保存的骨肉瘤细胞MG-63放置于37 ℃水浴锅中轻微摇动。观察细胞溶解后，转移至离心管中，加入含双抗和10%FBS的PRMI1640培养基，1 000 rpm，离心5 min，加入细胞生长液悬浮细胞，种植于细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2培养箱中培养。观察细胞贴壁大约为90%时，用0.25%胰蛋白酶消化液消化细胞，1 000 rpm，5 min离心。加入PBS溶液洗涤细胞两次，弃上清，加入细胞生长液，接种于新的细胞培养瓶中，37 ℃，5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 MTT法检测细胞增殖：取培养至对数生长期的骨肉瘤细胞MG-63，胰蛋白酶消化细胞，离心收集细胞，加入细胞生长液，调整每毫升细胞生长液中含细胞5×104个，取100 μl接种于96孔细胞培养板中，放置于CO2培养箱中，37 ℃，培养24 h，观察细胞完全贴壁后，加入同浓度的淫羊藿素药物刺激细胞。淫羊藿素设置5个浓度梯度，分别为4、8、16、32、64 μmol/L，培养时间分别为24、48、72 h。每组设置5个复孔提高实验的准确性，设置阴性对照组和空白组，阴性对照组中不加药物淫羊藿素只加入等量的生长液，而空白组中不加细胞加入等量的淫羊藿素药物。待药物作用时间结束后，加入体积为20 μl的MTT溶液，MTT溶液浓度为5 mg/ml，置于37 ℃，CO2培养箱中反应4 h，弃上清液，在细胞中加入DMSO溶液150 μl，避光条件下缓慢震荡10 min，观察结晶物完全溶解后，用酶联免疫检测仪检测各孔的吸光度(OD值)，实验重复3次，取平均值计算细胞抑制率。抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡：培养MG-63细胞至对数生长期，胰蛋白酶消化细胞，PBS反复洗涤离心后加入细胞生长液，调整细胞浓度为2×105个/孔，接种于6孔细胞培养板中，每孔加入细胞生长液2 ml，37 ℃，CO2培养箱中培养细胞24 h后，观察细胞完全贴壁，倒掉细胞生长液，分别在MG-63细胞中加淫羊藿素浓度为4、8、16、32 μmol/L的含药培养基，每孔中加入细胞生长液体积为2 ml。同时设对照组，对照组MG-63细胞中不加淫羊藿素，加入等量的DMSO溶液，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中孵育48 h，弃去含药培养基，加入PBS洗涤后，胰蛋白酶消化细胞，2 000 rpm，5 min，离心，加入PBS重悬，调整每孔中细胞数量大约为1×106个，2 000 rpm，5 min，收集细胞，在每组细胞中加入500 μl的结合缓冲液，混合均匀，重悬细胞。加入5 μl Annexin V，再加入5 μl PI混合，室温下孵育反应10 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)。实验重复3次。

1.2.4 淫羊藿素对骨肉瘤细胞侵袭力：骨肉瘤MG-63细胞经终浓度为4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用48 h后，胰蛋白酶消化细胞，加入不含FBS的RPMI1640培养基悬浮细胞，调整细胞浓度为3×103个/ml，加入到提前5 h用Matrigel包被过的Transwell小室内，每孔加入100 μl细胞悬浮液。在Transwell小室下部加入600 μl的含有FBS的完全培养基，放置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养48 h。用棉签小心擦掉Matrigel，用浓度为4%的多聚甲醛固定15 min，苏木素染色后，用水洗涤。显微镜下观察，计算细胞的侵袭力。

1.2.5 Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、MMP-9蛋白表达情况：骨肉瘤MG-63细胞经终浓度为4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用48 h后，胰蛋白酶消化细胞，收集细胞沉淀。细胞蛋白提取按照蛋白提取试剂盒说明书提取细胞中的蛋白。蛋白浓度检测用BCA蛋白浓度检测试剂盒说明书检测提取的蛋白浓度。将蛋白样品100 ℃煮沸5 min变性后。加入上样孔中，每孔中加入50 μl变性蛋白，电泳初始电压为80 V，电泳30 min后，调整电压为120 V直至电泳结束。转膜电流为30 mA，4 ℃转膜过夜。5%脱脂奶粉封闭后，依次与一抗和二抗孵育后，在暗室中曝光，分析蛋白表达含量。同时设置对照组，实验重复3次。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞增殖抑制情况 骨肉瘤细胞MG-63经4、8、16、32、64 μmol/L的淫羊藿素作用时间为24、48、72 h后，与对照组相比，淫羊藿素作用组的抑制作用明显，抑制率有显著差异(P<0.05)。作用浓度为4 μmol/L的细胞抑制率与作用浓度为8 μmol/L的细胞抑制率差异显著(P<0.05)，作用浓度为8 μmol/L的细胞抑制率与作用浓度为16 μmol/L的细胞抑制率差异显著(P<0.05)，作用浓度为16 μmol/L的细胞抑制率与作用浓度为32 μmol/L的细胞抑制率差异显著(P<0.05)，作用浓度为32 μmol/L的细胞抑制率与作用浓度为64 μmol/L的细胞抑制率无显著差异。药物作用时间为48 h与药物作用时间为24 h的细胞抑制率差异显著(P<0.05)，药物作用时间为72 h的细胞抑制率与作用时间为48 h的抑制率差异不显著。后期选用作用浓度为4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L的淫羊藿素，作用时间为48 h继续研究。淫羊藿素可以抑制骨肉瘤细胞的增殖，并且呈现浓度依赖和时间依赖。见表1、图1。

表1 MTT检测药物作用后的骨肉瘤细胞MG-63抑制情况

*P<0.05，与同浓度作用时间24 h比较，compared with same concentration treated for 24 h；#P<0.05，与同作用时间作用浓度分别为4、8、16 μmol/L比较，compared with same time and treated concentrations was 4,8,16 μmol/L

图1 MTT检测药物作用后的骨肉瘤细胞MG-63抑制情况Fig.1 Inhibitory of osteosarcoma cells MG-63 after drug action by MTT

2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 淫羊藿素浓度为4、8、16、32 μmol/L与骨肉瘤细胞MG-63作用时间为48 h后，经过Annexin V/PI双染色后，骨肉瘤细胞MG-63经淫羊藿素作用后，凋亡率随着药物浓度的增加而增加。计算骨肉瘤细胞经0、4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的细胞凋亡率依次为0.125 1±0.018 4、0.241 4±0.019 7、0.436 5±0.030 1、0.723 2±0.031 5、0.789 7±0.047。32 μmol/L淫羊藿素与16 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤细胞凋亡率差异显著(P<0.01)，16 μmol/L淫羊藿素与8 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤细胞凋亡率差异显著(P<0.01)，8 μmol/L淫羊藿素与4 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤细胞凋亡率差异显著(P<0.01)。结果与MTT法检测结果一致。见图2。

图2 淫羊藿素对MG-63细胞凋亡率影响 A：流式细胞仪检测结果；B：细胞凋亡率**P<0.01，与对照组比较Fig.2 Effect of MG-63 on the apoptosis rate of the MG-63 cells A:flow cytometry results;B:cells apoptosis rate**P<0.01，compared with control group

2.3 淫羊藿素对MG-63细胞侵袭力影响 淫羊藿素浓度为0、4、8、16、32 μmol/L作用48 h的骨肉瘤细胞MG-63，利用Transwell小室测定细胞侵袭力。结果显示，0、4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用后的骨肉瘤细胞MG-63侵袭力分别为571.47±5.14、385.26±3.45、290.31±3.04、210.78±4.25、189.25±1.86。浓度为4、8、16、32 μmol/L淫羊藿素作用后的骨肉瘤MG-63细胞侵袭力与对照组相比差异显著(P<0.01)。淫羊藿素可以减弱骨肉瘤MG-63细胞的侵袭能力，作用浓度越大，侵袭力抑制越明显。见图3。

图3 淫羊藿素对骨肉瘤MG-63细胞侵袭力影响 A：Transwell 小室结果图；B：侵袭细胞数**P<0.01，与对照组相比Fig.3 Effect of the osteosarcoma MG-63 cells invasive power after Icaritin treated. A:Transwell result；B:the invasion cell number**P<0.01，compared with control group

2.4 Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、MMP-9蛋白表达结果 骨肉瘤MG-63细胞经终浓度为4、8、16、32 μmol/L的淫羊藿素作用48 h后，提取细胞蛋白，Western blot检测细胞中Bcl-2、Bax、MMP-9表达水平。结果显示，淫羊藿素作用后的细胞中Bax蛋白表达随着淫羊藿素作用浓度的增加而逐渐降低。淫羊藿素作用后的细胞中Bcl-2、MMP-9蛋白表达随着淫羊藿素作用浓度的增加而逐渐降低(P<0.01)。见图4。

图4 淫羊藿素对MG-63细胞Bcl-2、Bax、MMP-9蛋白表达影响 A：Western blot结果图；B：蛋白表达率**P<0.01，与对照组比较Fig.4 Effect of the expression of Bcl-2, Bax and MMP-9 protein in MG-63 cells after Icaritin treated A:Western blot results ;B:protein expression rate**P<0.01，compared with control group

3 讨论

骨肉瘤是一种原发的恶性肿瘤，是一种始发于骨间叶细胞的肿瘤。在世界范围内，骨肉瘤的发病率位居第二，发病率在原发性骨肿瘤中仅次于骨髓瘤[6]。骨肉瘤的发病率占所有肿瘤发病率的0.3%。任何年龄阶段的人均可发病，青少年中的发病率最高，主要在膝关节部位发病，转移快，恶化快，治疗后易复发，早期诊断效果差。当患者出现典型的症状时，多数已经处于骨肉瘤晚期，耽误治疗时机[7]。上世纪七十年代，骨肉瘤的治疗方法主要为截肢，预后效果差，3～5年的生存率只有14%。随着骨肉瘤治疗技术手段的成熟，保肢治疗成为大多数骨肉瘤患者的首选[8]。现在治疗骨肉瘤的方法主要有手术治疗、放射治疗、化疗，化疗目前为止治疗效果较为显著，但是化疗出现的多药耐药成为目前治疗中的关键难题，迫切需要研究和开发新的治疗手段。

淫羊藿素是中草药淫羊藿的生物活性很强的一种衍生物，其分子结构与淫羊藿极为相似，是淫羊藿经过一系列复杂的过程而提取出来的[9]。淫羊藿具有抗肿瘤作用，成为近些年来研究的重点。淫羊藿素对肿瘤细胞的增殖抑制和诱导癌细胞凋亡作用已经在多种癌细胞中得以证实[10]。研究表明，淫羊藿素通过作用于ERK信号通路抑制子宫内膜癌细胞的生长。淫羊藿素对乳腺癌细胞具有明显的增殖抑制作用。Li[1]验证了淫羊藿素可以通过诱导细胞凋亡抑制肝癌细胞增殖分化作用。

MTT法是实验室常用的检测活细胞的实验技术手段。在活细胞的线粒体中含有琥珀酸脱氢酶，外源性的MTT在琥珀酸脱氢酶的作用下可以生成不溶于水的结晶甲瓒，死细胞中由于没有琥珀酸脱氢酶不能形成结晶，实验过程中加入DMSO后可以溶解甲瓒，用酶标仪检测细胞吸光度可以间接反应活细胞的数量。本研究选取了骨肉瘤细胞MG-63为研究对象，分别与不同浓度的淫羊藿素作用不同时间后，结果表明，与对照组相比，药物作用后的骨肉瘤细胞MG-63生长增殖明显受到抑制，并且抑制作用随着药物浓度的增加而增加，随着药物作用时间的增加而增加。

细胞凋亡是一种正常情况下的细胞死亡，在生命机体生长过程中具有重要作用。细胞凋亡是细胞为了维持内环境稳定而受基因调控的程序性死亡。细胞凋亡是一个复杂的过程，受多种因素调控[11-12]。细胞凋亡涉及到DNA内核小体断裂，细胞膜通透性改变，细胞质流失、染色质聚集等一系列过程。细胞凋亡有多种途径。在细胞凋亡早期，线粒体膜的通透性发生改变，位于线粒体内的质子泵将质子转运到外室，这样就在线粒体的内膜上形成了跨膜电位差。细胞为了消除这种跨膜电位，依赖电位的离子通道、己糖激酶和亲环蛋白等一系列化合物可以形成允许质子通过的PT孔，从而引起细胞凋亡，当细胞中PT孔受到抑制时，细胞凋亡就受到抑制[13-14]。本研究中通过流式细胞仪检测淫羊藿素浓度为4、8、16、32 μmol/L与骨肉瘤细胞MG-63作用48h后细胞凋亡情况，淫羊藿素可以促进骨肉瘤MG-63的凋亡。Transwell小室检测细胞侵袭力，淫羊藿素作用后的骨肉瘤MG-63细胞侵袭能力降低，随着作用浓度升高，侵袭力降低越明显。Western blot检测与细胞凋亡和侵袭相关蛋白结果发现，淫羊藿素作用后的细胞中Bax蛋白表达随着淫羊藿素作用浓度的增加而逐渐降低。淫羊藿素作用后的细胞中Bcl-2、MMP-9蛋白表达随着淫羊藿素作用浓度的增加而逐渐降低，这说明淫羊藿素对骨肉瘤细胞的作用与Bax、Bcl-2、MMP-9的表达有关。

综上所述，淫羊藿素可以有效抑制骨肉瘤细胞MG-63的增殖分化和促进细胞凋亡，减弱细胞的侵袭力，增殖抑制作用随着作用时间和作用浓度的增加而增加，淫羊藿素对骨肉瘤细胞的作用与Bax、Bcl-2、MMP-9有关。本研究为进一步探讨淫羊藿素对骨肉瘤细胞的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用机制提供了基础，为治疗骨肉瘤提供新的思路。

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(编校：苗加会)

Effect of Icaritin on the proliferation and differentiation and invasion of Osteosarcoma cells

WU Qing1Δ, FENG Qiong2, LIU Xing1

(1.Department of orthopedics, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China; 2.College of nursing, Nanchang University, Nanchang 330006, China)

ObjectiveTo study the effect and mechanism of Icaritin on the proliferation and differentiation of osteosarcoma cells.MethodsIn human osteosarcoma MG-63 cells as the research object, respectively, with 4,8,16,32,64 μmol/L concentration of Icaritin for 24 h,48 h,72 h,respectivelydivided control group.Cell proliferation was detected with MTT.The cell apoptosis rate was observed and calculated by flow cytometry after Annexin V/PI double staining of MG-63 for 4,8,16,32 μmol/L of 48 h.The Transwell assay by icaritin concentration of 4,8,16,32 μmol/L role after 48 h of human osteosarcoma MG-63 cells invasion ability.Western blot assay the expression of Bax, Bcl-2 and MMP-9 in cells.Resultscompared with the control group, the inhibitory rate of MG-63 was significantly different from that in the control group (P<0.05).Osteosarcoma cells were treated with 0,4,8,16,32 μmol/L,apoptosis rate were 0.125 1±0.018 4，0.241 4±0.019 7，0.436 5±0.030 1，0.723 2±0.031 5，0.789 7±0.047,further illustrates the icaritin is by promoting apoptosis of cancer cells and inhibit the proliferation of the cancer cells.The concentration of 4,8,16,32 μmol/L, after the role of osteosarcoma MG-63 cells invasion force compared with the control group significantly(P<0.01).The effect of MG-63 on the invasion of osteosarcoma cells was decreased, and the effect of the inhibition of the invasion was more obvious.The expression of Bax protein in the cells after the action of the Icaritin was decreased with the increase of the concentration .The expression of Bcl-2 and MMP-9 protein in the cells after the action of Icaritin was gradually decreased with the increase of the concentration.ConclusionIcaritin can inhibit the proliferation and invasion of osteosarcoma cells, promote apoptosis of osteosarcoma cells, the inhibition increases with the increase of icaritin concentration increased, promote cell apoptosis increased with time and concentration increase,its mechanism related to Bax, Bcl-2, MMP-9.

Osteosarcoma cell; Herba; proliferation inhibition; apoptosis

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.11

吴庆，通信作者，男，硕士，副主任医师，研究方向：脊柱方面，E-mail：825933047@qq.com。

R738.1

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