6-姜酚对MC3T3-E1成骨细胞增殖及分化的影响

刘斌，张琼

(安徽医科大学附属省立医院 药剂科，安徽 合肥 230001)

6-姜酚对MC3T3-E1成骨细胞增殖及分化的影响

刘斌Δ，张琼

(安徽医科大学附属省立医院 药剂科，安徽 合肥 230001)

目的 研究6-姜酚对MC3T3-E1成骨细胞增殖及分化的影响。方法 取MC3T3-E1成骨细胞培养，培养基加入含有 1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L的6-姜酚及15 mmol/L的高浓度葡萄糖作为实验组，仅加入15 mmol/L的高浓度葡萄糖作为对照组，MTT法检测MC3T3-E1成骨细胞增殖情况，ELISA法检测细胞中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨钙素(bone gla protein ，BGP)活性。结果 1×10-9～1×10-7mol/L的6-姜酚均能够显著地增加15 mmol/L高糖作用下的MC3T3-E1细胞生长并提升ALP活性，并能够明显地增强细胞骨钙素的分泌，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 6-姜酚能促进体外培养的MC3T3-E1成骨细胞增殖与骨向分化，这可能为其防治骨质疏松的机制之一。

6-姜酚；高浓度葡萄糖；MC3T3-E1成骨细胞；增殖；分化；碱性磷酸酶；骨钙素

骨质疏松的发生与Ⅰ型糖尿病有关，是公认的糖尿病并发症，在糖尿病患者的骨骼中，成熟的成骨细胞数量明显减少[1]。这提示：高血糖能够抑制成骨细胞的分化，导致骨矿化含量降低、骨质疏松、骨折增加、和骨折愈合周期增长[2-3]。因此，若能抑制或阻止高血糖的对成骨细胞作用，对于糖尿病所致骨质疾病具有重要的意义。

6-姜酚(1-4-羟基-3 -甲氧基苯基-5-羟基-3-癸酮)是生姜的一种重要有效成分，具有多种不同药理作用如：抗癌、抗氧化、抗炎、抗血小板聚集、抑制环氧合酶-2活性等[4]。高浓度葡萄糖是一种能够与蛋白质发生高度活化反应的还原糖，故将细胞长期暴露在高浓度葡萄糖中，可以产生细胞毒性反应。而6-姜酚具有很强的抗氧化活性，因此，本研究运用6-姜酚培养成骨细胞，观察其对成骨细胞增殖的影响，初步探讨6-姜酚预防骨质疏松的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器：311型CO2培养箱(美国Forma公司)；XD-101倒置相差显微镜(江南光电股份有限公司)。Bio-Elx-800 酶标仪(Bio-Rad公司)。MIKRO12-24 型台式离心机(HETT ICH公司)。

1.1.2 药物与试剂：6-姜酚(供含量测定用，成都瑞芬思生物科技有限公司，产品批号：A0218，含量均> 98%)；MTT、DMEM 培养基、含10%胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(美国Sigma公司)；碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(BGP)测试盒(上海高创化学科技有限公司)。

1.1.3 细胞：小鼠成骨细胞株MC3T3-E1，购于中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：小鼠成骨细胞MC3T3-E1在37 ℃、5%的二氧化碳保温箱及DMEM培养液中进行培养。培养液组分含有10%热灭活胎牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素和100 μg/mL的链霉素。当细胞达到一定的分化程度时，采用0.02%～0.05%的胰蛋白酶消化液进行传代培养。细胞被接种于6孔板中，并在细胞长至铺满瓶底约90%后，用含有10 mmol/L的β-磷酸甘油和50 μg/mL抗坏血酸进行处理以在体外成骨。分为实验组(含1×10-9、1×10-8、1×10-7mol/L的6-姜酚和15 mmol/L的高浓度葡萄糖)、对照组(含15 mmol/L的高浓度葡萄糖)，培养液2～3 d更换1次，在24、48、96 h，分别检测细胞活性及碱性磷酸酶活性，并在1、2、14 d检测骨钙素的分泌情况，在这期间细胞培育在2%胎牛血清培养液中。

1.2.2 细胞增殖情况检测：用MTT法测定6-姜酚对MC3T3-E1成骨细胞的增殖作用。细胞接种在24孔板中，细胞密度为2×104/孔。6-姜酚作用细胞24、48、96 h后，MTT比色法检测细胞活性、增殖和正常生长。将MTT溶液(0.5 mg/mL)加至细胞中并在37 ℃条件下培养，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中。3 h后，除去残余的MTT，结晶甲瓒在二甲基亚砜中孵化30 min后被溶解。摇动24孔板5 min并在570 nm处采用酶标仪测量其吸光度A值。

1.2.3 碱性磷酸酶活性检测：6-姜酚作用细胞24、48、96 h后，弃去细胞培养液后用PBS轻轻地冲洗2次，用0.2%的Triton X-100裂解液处理后，在14000×g条件下离心5 min。测定上清液中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的活性。ALP用碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行测定。取新鲜配制的底物液100 μL，加40 μL细胞裂解液, 37 ℃温箱内孵育30 min,加氢氧化钠100 μL终止反应，波长为410 nm, 酶标仪检测吸光度A值。

1.2.4 骨钙素含量检测：6-姜酚作用细胞24、48、96 h后按、骨钙素(bone gla protein，BGP)含量检测说明检测性，简要步骤如下：准备试剂、样品和标准品，加入准备好的样品和标准品，生物素标记的二抗，37 ℃反应60 min，洗板5次，加入显色液 A、B，37 ℃显色15 min，加入终止液，10 min内在450 nm波长处测定A值，计算。

2 结果

2.1 6-姜酚对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响 在24、48、96 h与对照组比较，不同浓度6-姜酚组对MC3T3-E1 成骨细胞增殖程度显著升高(P<0.05)。对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响见表1。

表1 6-姜酚对MC3T3-E1成骨细胞增殖的影响

*P<0.05,与对照组比较,compared with the control group

2.2 6-姜酚对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响 在24、48、96 h，与对照组比较，不同浓度6-姜酚组MC3T3-E1细胞ALP活性显著增强(P<0.05)，这种促进作用随时间增加而增强。6-姜酚对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响见表2。

表2 6-姜酚对MC3T3-E1细胞ALP活性的影响

*P<0.05,与对照组比较,compared with the control group

2.3 6-姜酚对MC3T3-E1细胞BGP活性的影响 在24、48、96 h，与对照组比较，3个浓度在3个时间点的6-姜酚对MC3T3-E1细胞BGP活性显著增强(P<0.05)。6-姜酚对MC3T3-E1细胞BGP活性的影响见表3。

表3 6-姜酚对MC3T3-E1细胞BGP活性的影响

*P<0.05,与对照组比较,compared with the control group

3 讨论

骨质疏松发病的主要原因是雌激素缺乏引发的成骨细胞的骨形成不足和破骨细胞的骨吸收亢进导致的骨重建失衡; 成骨细胞不仅决定骨的形成，同时也调节破骨细胞对骨的吸收，是骨代谢的主要功能细胞，成骨细胞增殖和分化在很大程度上决定了最终形成的骨量[5]。细胞外葡萄糖水平升高能显著地影响细胞功能，包括：细胞内、外蛋白质和DNA的非酶糖基化；调节细胞的氧化还原状态；改变细胞的代谢途径，如激活多元醇通路；蛋白激酶C的激活。这些改变及可能存在于信号转导通路、转录因子活动中，还有一些难于识别的变化都可能直接影响细胞包括成骨细胞等的生长、分化和其他功能[6]。MC3T3-E1是前骨细胞在β-磷酸甘油和L-抗坏血酸共同作用条件下发生分化和矿化后的成骨细胞，是研究药物对成骨细胞影响的有价值的体外细胞模型[7]。成骨细胞产生胶原、骨钙素及碱性磷酸酶等的特性与骨基质的成熟和骨化有关。因此本实验利用该体外实验模型，探讨6-姜酚对高浓度葡萄糖诱导下小鼠成骨细胞功能障碍和氧化应激反应的保护作用。

本研究主要以成骨细胞的增殖来考察6-姜酚对成骨细胞代谢的影响。MTT法是检测细胞增殖活力的一种简便、准确的方法。MTT实验结果表明：1×10-9～1×10-7mol/L浓度下的6-姜酚单独作用于成骨细胞并没有显示出细胞毒性反应。当细胞在1×10-9～1×10-7mol/L的6-姜酚作用下同时加入了15 mmol/L高浓度葡萄糖时，与仅使用高浓度葡萄糖作用下的对照组相比，3种不同浓度的6-姜酚均显著地增加了MC3T3-E1细胞的生长作用(P<0.05)，提示：6-姜酚能够抑制高糖诱导下的细胞毒性，并且促进成骨细胞的增殖，这为6-姜酚治疗糖尿病引起的骨质疏松症提供了依据。

碱性磷酸酶(ALP)是主要分布于细胞的钙结合转运蛋白，可促进细胞成熟、钙化，是成熟成骨细胞的重要表面标志，代表成骨细胞的活性，也是骨形成的标志，能较准确地反映机体成骨细胞的状况。本实验结果表明：与对照组比较，在1×10-9～1×10-7mol/L 6-姜酚均使MC3T3-E1细胞ALP活性显著增强(P<0.05)，说明6-姜酚促进成骨细胞活动增强时，ALP活性升高。

骨钙素在调节细胞的分化、骨基质形成与骨化的过程中起着关键的作用，是成骨细胞成熟的标志，被认为是成骨细胞功能的特异性标志，成骨细胞活性增强，骨钙素水平升高，反之下降。本实验结果表明：在14 d内，与对照组比较，1×10-9～1×10-7mol/L的6-姜酚使MC3T3-E1细胞BGP活性显著增强(P<0.05)。

上述结果提示，6-姜酚具有促进成骨细胞MC3T3-E1各时期分化的作用，说明6-姜酚在糖尿病引起的骨质疾病的治疗中有广泛的应用价值。

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[4]王维皓,王智民.姜的化学、药理研究进展.中国中药杂志[J].2005，30(20)：1569-1573.

[5]蒿长英，任艳玲.赵金茹左归丸含药血清通过ERK/Smads信号通路干预MC3T3-E1细胞的功能基因表达[J].中国药理学通报，2012,28(6):872-876.

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(编校：王俨俨)

Effects of 6-gingerol on the proliferation and differentiation of osteoblastic cellsinvitro

LIU BinΔ, ZHANG Qiong

(Department of Pharmacy, Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University, Hefei 230001, China)

Objective To explore the efficacy of 6-gingerol on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells culturedinvitro.MethodsMC3T3-E1 osteoblastic cells were collected and cultured by 6-gingerol of 1×10-9mol/L,1×10-8mol/L,1×10-7mol/L with 15 mmol/L high glucose as the experimental group,cultured in 15 mmol/L high glucose as the control group.The proliferation of MC3T3-E1 osteoblastic cells was determined by MTT,and the activities of alkaline phosphatase(alkaline phosphatase，ALP),bone gla protein(bone gla protein，BGP) were determined by ELISA.ResultsThe ratio of MC3T3-E1 osteoblastic cells proliferation was increased in 15 mmol/L high glucose containing 1×10-9-1×10-7mol/L 6-gingerol significantly increased the growth of MC3T3 E1 - cell which containing the action of high glucose of 15 mmol/L,increased the activity of ALP, and it caused a significant elevation of the activity of alkaline phosphatase (ALP) and the osteocalcin secretion of the cells, with statistical significant differences (P<0.05).Conclusion6-gingerol could promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblastic cells which is culturedinvitro,it may be one of its mechanism of preventment and the treatment of osteoporosis.

6-gingerol; high glucose; MC3T3-E1 osteoblastic cells; proliferation; differentiation; alkaline phosphatase; osteocalcin

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.08

刘斌，通信作者，男，硕士，副主任药师，研究方向：临床药学,E-mail：liubinhf@sina.com。

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