莱菔硫烷抑制宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖的机制研究

杨晓明，李彩红，孙冬霞，窦海燕

(1.邯郸市妇幼保健院 妇一科，河北 邯郸 056001；2.邯郸市妇幼保健院 病理科，河北 邯郸 056001)

莱菔硫烷抑制宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖的机制研究

杨晓明1Δ，李彩红1，孙冬霞2，窦海燕1

(1.邯郸市妇幼保健院 妇一科，河北 邯郸 056001；2.邯郸市妇幼保健院 病理科，河北 邯郸 056001)

目的 研究莱菔硫烷对宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖的影响，并探讨其可能机制。方法 将莱菔硫烷作用于人宫颈癌HeLa细胞，采用MTT和Edu比色法检测细胞体外增殖的抑制作用；采用Western blot检测c-Myc的蛋白表达水平，肿瘤球形成实验检测莱菔硫烷对肿瘤干细胞的影响。结果 MTT和Edu比色法显示，莱菔硫烷能抑制宫颈癌Hela细胞的体外增殖，Western blot 结果表明，莱菔硫烷可以下调c-Myc蛋白的表达从而抑制增殖。结论 莱菔硫烷对宫颈癌Hela细胞增殖具有明显的抑制作用；其机制可能与下调c-Myc表达有关。

莱菔硫烷；宫颈癌；Hela细胞；增殖；c-Myc

宫颈癌是女性各种恶性肿瘤中最常见的癌症，在全球恶性肿瘤中发病率高居第2位，病死率居第4位，全世界每年有超过25万患者死于宫颈癌[1]，宫颈癌已成为严重危害妇女健康的恶性疾病。宫颈癌患者死亡的主要原因是肿瘤复发和转移，虽然已经有一部分化疗药物运用于临床，如顺铂、异环磷酰胺、5-氟尿嘧啶等，但效果不甚理想，化疗药物副作用大且容易产生耐药，增加了宫颈癌的治疗难度，因此从天然植物中寻找高效低毒的抗肿瘤活性成分成为国内外研究的热点。莱菔硫烷(Sulforaphane，SF)是一种从绿花椰菜或绿花椰菜幼芽中提取的经葡糖异硫氰酸盐转化的天然化合物，它一方面可以促进成癌细胞的细胞凋亡和细胞阻滞，另一方面可诱导机体产生Ⅱ型解毒酶——谷胱甘肽转移酶(GST)和醌还原酶(QR)，此酶能中和可疑致癌物质，防止致癌物质破坏健康细胞内的遗传因子，从而起到抗癌作用[2-3]。值得肯定的是该成分不会在人体内残留，对机体无副作用，可以作为一种新型的抗癌成分，它的抗肿瘤效应在不同的肿瘤中已经得到证实。例如，口服或静脉注射莱菔硫烷可抑制前列腺癌PC-3和胰腺癌Panc-1移植瘤的肿瘤生长[4-5]；绝经前妇女可通过口服莱菔硫烷来降低人患乳腺癌的风险[6]，此外莱菔硫烷还可以逆转肿瘤耐药和复发[7]。研究表明，莱菔硫烷可以通过诱导配体干扰NF-kB抗凋亡通路，引起TNF-a相关凋亡从而有效阻断胰腺癌的肿瘤耐药[5]。莱菔硫烷即使在较低的药物浓度下仍可以有效抑制乳腺癌干细胞[8]。

c-Myc基因是myc基因家族的重要成员之一，属核蛋白基因，具有转化细胞的能力，并具有与染色体DNA结合的特性，在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用[11-13]。目前认为很多恶性肿瘤中都有myc基因的扩增或过度表达，c-Myc基因和产物在宫颈癌的发生和发展中起重要作用[13-16]，有可能成为判断预后的一个指标，同时也成为治疗宫颈癌的潜在靶点。

已有研究证实莱菔硫烷可以促进宫颈癌细胞的凋亡[17-18]，但关于莱菔硫烷抑制宫颈癌细胞增殖及其机制的研究较少。本实验将探讨莱菔硫烷对宫颈癌细胞株HeLa增殖的影响，观察莱菔硫烷是否可抑制宫颈癌细胞的生长，是否可调控与宫颈癌呈密切相关的致癌基因c-Myc的表达。目的是从细胞与分子生物学水平探讨莱菔硫烷抑制宫颈癌细胞生长的作用机制，为临床治疗宫颈癌提供有效理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:人宫颈癌细胞株HeLa细胞购于自中国协和医科大学细胞中心。

1.1.2 试剂：Sulforaphane (Sigma,America)溶解于无菌的二甲基亚砜(DMSO)中，配制成浓度为10 mmol/L的贮存液， -20 ℃ 保存，RPMI培养基和胎牛血清(Hyclone)MTT(噻唑蓝)，DMSO,Edu试剂盒均购自广州斯佳生物公司。Wesern blot中使用的抗体来源：c-Myc(Santa Cruz,America)，GAPDH(北京康为世纪)。

1.1.3 仪器：细胞培养超净工作台(苏净集团安泰公司)；垂直凝胶电泳系统、蛋白质转膜及曝光仪和Model 680酶标仪(Bio-Rad 公司)；正置荧光显微镜(Eclipse 80i，尼康公司)；光学显微镜(BDS200，日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：HeLa细胞株采用5%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，青霉素100 U/mL,链霉素100 ug/mL,于37 ℃，5%CO2培养箱内培养，含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)实验检测HeLa细胞对莱菔硫烷的药物敏感性(IC50)：于96孔板中按照每孔2×103个细胞接种，每孔体积200 μL,每组设3个复孔，同时设空白对照，第2天分别加入不同浓度的莱菔硫烷稀释液(浓度分别为80、40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L)各培养3 d。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL,37 ℃培养4 h后小心弃去培养基，加入150 μL DMSO,室温避光摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解，以空白孔为对照，用酶标仪490 nm波长测定各孔吸光度值(OD值)，OD值的大小表示细胞增殖能力大小。各组取平均值，重复3次，绘制细胞生长曲线，OD值为0.5左右的对应的是药物的IC50。

1.2.3 MTT实验检测莱菔硫烷对HeLa细胞增殖能力的影响：于96孔板中按照每孔1×103个细胞接种，每孔体积200 μL，每组设3个复孔，同时设空白对照组不加药，处理组加入10 μmol/L的莱菔硫烷稀释液各培养5 d。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃培养4 h后小心弃去培养基，加入150 μL DMSO，室温避光摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解，以空白孔为对照，用酶标仪490 nm波长测定各孔吸光度值(OD值)，OD值的大小表示细胞增殖能力大小。各组取平均值，重复3次，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 Edu实验：以每孔4×103细胞接种于96孔板中，加入10 μmol/L的莱菔硫烷稀释液，培养48 h后用细胞培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液，培养4 h，PBS清洗细胞2次，每次5 min，经4%甲醇固定和Apollo染色，DAPI染核，显微镜下观察多视野拍照计数。

1.2.5 Western blot检测c-Myc蛋白的表达水平：HeLa细胞加入10 μmol/L莱菔硫烷处理后，分别作用24、48 h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗细胞2次，加入细胞裂解液100 uL，置于冰上裂解30 min，12000 g 4 ℃离心15 min，收集上清-80 ℃保存，按BCA蛋白检测试剂盒中的方法进行蛋白浓度的测定。用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，凝胶上的蛋白带转移到PVDF膜上，以3%BSA室温封闭1 h,按照1:1000的比例分别加入一抗c-Myc和内参抗体GAPDH，4 ℃孵育过夜，加入相对应的二抗孵育1 h，于暗室曝光显影、定影。

2 结果

2.1 HeLa细胞对莱菔硫烷的药物敏感性(IC50)的检测 莱菔硫烷在2.5～80 μmol/L的范围内均可以抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖， 10 μmol/L的莱菔硫烷，对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制率为55.3%。可视作HeLa细胞对莱菔硫烷的IC50=10 μmol/L，作为后续试验加药浓度的基础。见图1。

图1 MTT检测HeLa细胞对莱菔硫烷的药物敏感性Fig.1 The sensitivity of HeLa Cells to Sulforaphane examined by MTT

2.2 MTT检测莱菔硫烷对宫颈癌HeLa细胞体外增殖能力的影响 与对照组相比，随着处理时间增加，莱菔硫烷处理组HeLa细胞的增殖能力明显减弱，第3天时2组细胞数量差异即有统计学意义(P<0.05)。表明莱菔硫烷可以抑制宫颈癌细胞的增殖。见图2。

图2 MTT检测莱菔硫烷对宫颈癌HeLa细胞体外增殖能力的影响NC：对照组；SF：莱菔硫烷处理组*P<0.05Fig.2 Effect of sulforaphane on the growth of Hela cell detected by MTTNC：control group；SF：Sulforaphane-treated group*P<0.05

2.3 Edu实验检测莱菔硫烷对宫颈癌HeLa细胞体外增殖能力的影响 与对照组[(45.2±3.6)%]相比，莱菔硫烷处理组[(20.6±4.8)%] HeLa细胞的增殖能力明显减弱(t=15.16，P=0.021)，表明莱菔硫烷可以抑制宫颈癌细胞的增殖。见图3。

图3 Edu检测莱菔硫烷对宫颈癌HeLa细胞体外增殖能力的影响(×20)NC：对照组；SF：莱菔硫烷处理组*P<0.05，与NC组相比Fig.3 Effect of sulforaphane on the growth of Hela cell detected by Edu(×20)NC：control group；SF：Sulforaphane-treated group*P<0.05，compared with NC group

2.4 Western blot 检测莱菔硫烷对HeLa细胞中c-Myc表达的影响 与对照组相比，经莱菔硫烷处理的细胞c-Myc的蛋白明显下调(F=149.188，P<0.001)，48 h组比24 h组的c-Myc蛋白表达更低(P<0.001)，表明药物的作用呈时间依赖性。见图4。

图4 Western blot 检测莱菔硫烷对HeLa细胞中c-Myc表达的影响**P<0.001Fig.4 Effect of sulforaphane on the expression of c-Myc detected by Western blot**P<0.001

3 讨论

肿瘤细胞的无限增殖能力赋予其永生化和转移的能力，是导致临床治疗失败的关键原因。现有的化疗药物治疗效果不甚满意，且副作用大，容易引起耐药，是化疗药物治疗肿瘤的缺陷。寻求副作用小且无毒的植物成分成为近年来抗肿瘤药物研究的热点，国内外大量研究表明莱菔硫烷在体内外对多种肿瘤细胞的增殖具有抑制作用并可促进细胞凋亡[4-5]。本研究也发现莱菔硫烷在2.5～80 μmol/L浓度范围均能抑制人宫颈癌HeLa细胞的增殖，MTT和Edu实验显示10 μmol/L的莱菔硫烷可以明显的抑制细胞增殖。

c-Myc基因不仅参与肿瘤细胞的调控增殖，分化与凋亡，而且参与肿瘤的发生和发展[19]，可以促进G0期细胞转入分裂周期,微注射c-Myc蛋白于细胞质，发现其可以转移至细胞核，促使细胞进入增殖周期[20-21]。许多恶性肿瘤组织中c-Myc基因表现异常，如c-Myc基因扩增，mRNA转录水平升高，都可以促进肿瘤细胞的过度增殖。同时c-Myc还可以促进肿瘤干细胞的发生[20]，它通过自我更新和无限增值维持着肿瘤细胞群的生命力，它的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能，且可以长时间处于休眠状态，对化疗药物和放疗不敏感，从而导致肿瘤细胞往往在常规治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞一段时间后复发。

Edu(5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，通过基于Edu与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性，是一种新型的研究细胞增殖的实验。

目前关于莱菔硫烷抑制宫颈癌细胞增殖机制的研究甚少，本文采用Western blot检测莱菔硫烷对c-Myc蛋白的表达水平的影响，研究发现，莱菔硫烷可以明显降低c-Myc蛋白的表达，已有研究证明莱菔硫烷可以直接结合c-Myc的启动子区域而下调其表达水平[21],与本研究结果一致。本研究结果为莱菔硫烷临床治疗宫颈癌物提供了理论支持。

综上所述，莱菔硫烷抑制HeLa细胞增殖，其机制可能是通过下调c-Myc蛋白的表达来实现。

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编校(苗加会)

Study on the inhibitory effects and mechanism of Sulforaphane on human cervical cancer Hela cell

YANG Xiao-ming1Δ, LI Cai-hong1, SUN Dong-xia2, DOU Hai-yan1

(1.Department of Gynecology, Handan Maternal and Child Health-Care Hospital, Handan 056001, China; 2.Department of Pathology, Handan Maternal and Child Health-Care Hospital, Handan 056001, China)

ObjectiveTo determine the effect of sulforaphane on human cervical cancer HeLa cells as well as its potential mechanism.MethodsThe proliferation activity were examined by MTT and Edu assay after treated with sulforaphane.Western blot was used to detect the expression level of c-Myc.ResultsMTT and Edu assay showed that sulforaphane can inhibit the growth of Hela cells, and the results of Western blot indicated that sulforaphane downregulated the expression of c-Myc protein.ConclusionSulforaphane can significantly suppress the proliferation of HeLa cells.The mechanism may be associated with reduced expression of c-Myc.

Sulforaphane; Cervical cancer; Hela cells; Proliferation; c-Myc

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.07.09

杨晓明，通信作者，女，本科，副主任医师，研究方向:妇科肿瘤疾病诊治研究，E-mail:yangxiaomingppa@163.com。

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