水飞蓟中木脂素的发现及其生物活性研究

张艳 彭玉勃 陈效忠 宋丽艳

[摘要]以蒸馏水为溶剂回流提取水飞蓟种子，提取物依次过D101大孔树脂、MCI树脂、MPLC色谱、HPLC色谱等色谱分离纯化得到7个化合物。经NMR解析确定化合物1～7分别为tricin 4′O[threoβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（1）， tricin 4′O[erythroβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（2）， 5′methoxyhydnocarpinD（3）， palstatin（4），（8R，7′S，8′R）5，5′dimethoxy7oxolariciresinol 9′ODxylopyranoside（5）， 9ODglucopyranoside（6），（-）haplomyrtoside（7）。化合物1，3～5具有较强的抗流感病毒（H5N1）活性， IC50分别为065， 021， 032和056 μmol·L-1，SI（SI=TC50/IC50）分别为125， 35， 106， 78。化合物1，2，6，7具有较好的抗人肝癌细胞（HepG2）活性，IC50分别为035， 025， 053， 066 μmol·L-1。化合物1～7为从该植物中首次分离得到。

[关键词]水飞蓟；木脂素； 抗流感病毒活性； 细胞毒活性

[Abstract]The seeds of Silybum marianum were extracted by hot water， and the extract was isolated by D101 macroporous resin， MCI resin， MPLC， HPLC， et al As a result， 7 compounds including tricin 4′O[threoβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（1）， tricin 4′O[erythroβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether（2）， 5′methoxyhydnocarpinD（3），palstatin（4），（8R，7′S，8′R）5，5′dimethoxy7oxolariciresinol 9′ODxylopyranoside（5）， 9ODglucopyranoside（6）， and（-）haplomyrtoside（7） were isolated and identified for the first time Compounds 1， 3， 4， and 5 exhibited activity against influenza A（H5N1）with IC50 value of 065， 021， 032， and 056 μmol·L-1， respectively Compounds 1， 2， 6， and 7 exhibited cytotoxity against HepG2 with IC50 value of 035， 025， 053， 066 μmol·L-1， respectively

[Key words]Silybum marianum； lignan； antiinfluenza virus activity； cytotoxity

doi：10.4268/cjcmm20160915

水飞蓟Silybum marianum （L）Gaertn是菊科水飞蓟属植物，性凉、味苦、归肝、胆经。具有清热解毒，舒肝利胆之功效。用于治疗肝胆湿热、胁痛、黄疽等证。水飞蓟特有成分为黄酮型木脂素类化合物，统称为水飞蓟素（silymarin），主要包括水飞蓟宾（silybin）、异水飞蓟宾（isosilybin）、水飞蓟宁（silydianin）、水飞蓟亭（silychristin）、脱氢水飞蓟宾（dehydrosisilybin）、聚水飞蓟宾（silybinomer）等[1]。除以上成分外，日本学者竹本常松等还获得2种新的黄酮型木脂素：2，3脱氢水飞蓟宾（2，3dehydrosilmarin）和2，3脱氢水飞蓟亭（2，3dehydrosilychristin）。本课题组前期研究中分离得到了水飞蓟中5个黄酮类化合物[2]，然而没有得到黄酮型木脂素类化合物。为了继续寻找具有生物活性的黄酮型木脂素类化合物，课题组继续对水飞蓟进行成分与活性的研究。

1材料

核磁共振谱：INOVA500核磁共振仪， 溶剂峰为内标； 分析型HPLC：Agilent 1100 Series 型高效液相色谱仪， DADUV 检测器， YMC C18（46 mm×150 mm，5 μm）色谱柱， 以及Diamonsil C18（46 mm×250 mm，5 μm）色谱柱； 制备型HPLC：Shimadazu LC6AD， SPD6A， SPD10A 紫外检测器， SPD紫外检测器， YMCPack ODSA（20 mm×250 mm，10 μm）色谱柱； 制备型MPLC：Biotage 公司FLASH，ODS（50 mm×60 mm， 10 μm）色谱柱。

水飞蓟药材于2014年10月采集于黑龙江省佳木斯地区，经黑龙江中医药大学佳木斯学院陈效忠副教授鉴定为水飞蓟S marianum种子。

2提取与分离

干燥的水飞蓟种子10 kg，粉碎后用蒸馏水回流提取3次，每次1 h。提取液减压浓缩成浸膏（10 kg）。将浸膏混悬于水中，过D101型大孔吸附树脂柱色谱，乙醇水（0%，30%，50%，95%）洗脱，其中水洗脱部分得浸膏200 g，30%乙醇洗脱部分得浸膏300 g，50%乙醇洗脱部分得浸膏400 g，95%乙醇洗脱部分得浸膏90g。50%乙醇洗脱部分进行MCI柱色谱分离，乙醇水（0%，30%，50%，95%）洗脱，其中水洗脱物50 g，30%乙醇洗脱部分得浸膏150 g，50%乙醇洗脱部分得浸膏150 g，95%乙醇洗脱部分得浸膏40 g 。30%乙醇洗脱部分进行MPLC柱色谱分离，甲醇水（0%～95%）梯度洗脱，薄层色谱检识，合并相似洗脱流分，得到8个组分（A1～A8）。A3组分经HPLC制备型色谱仪分离（色谱条件为甲醇水 2∶8，流速5 mL·min-1），得到化合物1（10 mg，tR=25 min），2（8 mg，tR=30 min），3（5 mg，tR=33 min）；A5组分经HPLC制备型色谱仪分离（色谱条件为甲醇水 1∶3，流速5 mL·min-1），得到化合物4（10 mg，tR=32 min），5（8 mg tR=33 min），6（5 mg，tR=35 min）；A7組分经HPLC制备型色谱仪分离（色谱条件为甲醇水3∶7，流速5 mL·min-1），得到化合物7（10 mg，tR=37 min）。

3结构鉴定

化合物1白色粉末，盐酸镁粉呈阳性反应。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：660（1H，s，H3），615（1H，s，H6），640（1H，s，H8），708（1H，s，H2′），708（1H，s，H6′），385（2H，s，H3′，5′），692（1H，br s，H2″），677（1H，br s，H5″），681（1H，m，H6″），447（1H，d，J=60，H7″），445（1H，m，H8″），392（1H，dd，J=120，44 Hz，H9″a），375（1H，dd，J=120，33 Hz，H9″b），385（3H，s，3″OCH3），386（3H，s，7″OCH3）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1660（C2），1055（C3），1835（C4），1535（C5），1005（C6），1671（C7），953（C8），1595（C9），1057（C10），1278（C1′），1048（C2′），1547（C3′），1405（C4′），1545（C5′），1048（C6′），555（C3″和H5″OCH3 ），1313（C1″），1123（C2″），1489（C3″），1481（C4″），1157（C5″），1223（C6″），839（C7″），869（C8″），618（C9″），559（3″OCH3），558（7″OCH3）。以上波谱数据与文献[3]报道的化合物一致，故鉴定该化合物为tricin 4′O[threoβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether。

化合物2白色粉末，盐酸镁粉呈阳性反应。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：661（1H，s，H3），616（1H，s，H6），642（1H，s，H8），709（1H，s，H2′），709（1H，s，H6′），385（2H，s，H3′，5′），695（1H，br s，H2″），678（1H，br s，H5″），682（1H，m，H6″），490（1H，d， J=45 Hz，H7″），446（1H，m，H8″），395（1H，dd， J=120，44 Hz，H9″a），376（1H，dd， J=120，33 Hz，H9″b），387（3H，s，3″OCH3），388（3H，s，7″OCH3）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1663（C2），1056（C3），1837（C4），1539（C5），1006（C6），1671（C7），955（C8），1597（C9），1059（C10），1272（C1′），1049（C2′），1549（C3′），1407（C4′），1546（C5′），1049（C6′），556（C3″和H5″OCH3 ），1315（C1″），1125（C2″），1491（C3″），1482（C4″），1158（C5″），1206（C6″），748（C7″），869（C8″），619（C9″），556（3″OCH3），557（7″OCH3）。以上以上波谱数据与文献[3]报道的化合物一致，故鉴定该化合物为tricin 4′O[erythroβguaiacyl（7″Omethyl）glyceryl] ether。

化合物3白色粉末，盐酸镁粉呈阳性反应。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：705（1H，d，J=20 Hz，H2″），685（1H，d，J=81 Hz，H5″），689（1H，dd，J=91，20 Hz，H6″），379（3H，s，C3″OMe），395（3H，s，C5″OMe），678（1H，s，H3），620（1H，d，J=21 Hz，H6），655（1H，d，J=23 Hz，H8），363（1H，m，H11a），339（1H，m，H11b），426（1H，m，H12），499（1H，d，J=91 Hz，H13），729（1H，d，J=21 Hz，H2′），735（1H，d，J=21 Hz，H6′）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1643（C2），1039（C3），1818（C4），1234（C5），1258（C6），1629（C7），942（C8），1573（C9），1036（C10），618（C11），786（C12），759（C13），568（COMe），1227（C1′），1082（C2′），442（C3′），1366（C4′），1482（C5′），1029（C6′），1278（C1″），1175（C2″），479（C3″），1476（C4″），1154（C5″），1206（C6″）。以上以上波谱数据与文献 [4]报道的化合物一致，故鉴定该化合物为5′methoxyhydnocarpin D。

化合物4白色粉末，盐酸镁粉呈阳性反应。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：698（1H，s，H3），617（1H，d，J=25 Hz，H6），650（1H，d，J=25 Hz，H8），336（1H，dd，J=110 ，40 Hz，H11a），360（1H，J=d，110 Hz，H11b），425（1H，ddd，J=110，80，10 Hz，H12），493（1H，d，J=80 Hz，H13），730（1H，d，J=35 Hz，H2′），390（3H，s，5′OCH3），675（2H，s，H2″，6″），375（2H，s，H3″，5″）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1630（C2），1045（C3），1819（C4），1616（C5），995（C6），1648（C7），945（C8），1578（C9），1039（C10），600（C11），785（C12），766（C13），1222（C1′），1083（C2′），1445（C3′），1368（C4′），1490（C5′），1029（C6′），556（5′OCH3 ），1263（C1″），1053（C2″，6″），1478（C3″，5″），1361（C4″），560（C3″，5″）。以上以上波譜数据与文献 [4] 报道的化合物一致，故鉴定该化合物为palstatin。

化合物5白色粉末。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：773（1H，br s，H2），775（1H，br s，H6），485（1H，m，H8），468（1H，dd，J=110，80 Hz，H9a），440（1H，t，J=80 Hz，H9b），385（3H，s，OCH3），728（1H，br s，H2′），728（1H，br s，H6′），539（1H，d，J=85 Hz，H7′），316（1H，m，H8′），448（1H，dd，J=115，30 Hz，H9′a），395（1H，dd，J=115 ，45 Hz，H9′b），382（3H，s，OCH3），478（1H，d，J=82 Hz，H1″），406（1H，t，J=85 Hz，H2″），413（1H，t，J=85 Hz，H3″），406（1H，m，H4″），430（1H，dd，J=110 ，50 Hz，H5″a），368（1H，t，J=110 Hz，H5″b）； 13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ：1279（C1），1079（C2），1486（C3），1437（C4），1489（C5），1084（C6），1985（C7），492（C8），706（C9），565（OCH3），1312（C1′），1052（C2′），1495（C3′），1378（C4′），1495（C5′），1053（C6′），845（C7′），535（C8′），765（C9′），566（OCH3），1057（C1″），747（C2″），788（C3″），711（C4″），673（C5″）。以上波谱数据与文献[5] 报道的化合物一致，故鉴定该化合物为（8R，7′S，8′R）5，5′dimethoxy7oxolariciresinol 9′ODxylopyranoside。

化合物6白色粉末。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：695（1H，d，J=20 Hz，H2），670（1H，d，J=80 Hz，H5），780（1H，dd，J=80 ，20 Hz，H6），555（1H，d，J=65 Hz，H7），356（1H，m，H8），401（1H，m，H9a），382（1H，m，H9b），377（3H，s，OCH3），675（1H，br s，H2′），668（1H，br s，H6′），257（1H，br t，J=80 Hz，H7′），177（1H，m，H8′），352（2H，t，J=65 Hz，H9′），380（3H，s，OCH3），430（1H，d，J=76 Hz，H1″），328（1H，m，H2″），327（1H，m，H3″），323（1H，m，H4″），332（1H，m，H5″），368（1H，t，J=110 Hz，H6″a），358（1H，m，H6″b）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1346（C1），1109（C2），1495（C3），1477（C4），1169（C5），1195（C6），892（C7），533（C8），727（C9），567（OCH3），1368（C1′），1182（C2′），1457（C3′），1478（C4′），1295（C5′），1143（C6′），330（C7′），358（C8′），623（C9′），566（OCH3），1046（C1″），756（C2″），786（C3″），717（C4″），689（C5″），629（C5″）。以上波谱数据与文献[5] 报道的化合物一致，故鉴定该化合物为9ODglucopyranoside。

化合物7白色粉末。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：552（1H，d，J=35 Hz，Hl″），455（1H，d，J=35 Hz，H2″），395（1H，d，J=100 Hz，H4″α），445（1H，d，J=100 Hz，H4″β），372（1H，d，J=115 Hz，H5″α），375（1H，d，J=115 Hz，H5″β），405（3H，s，OCH3），770（1H，s，H5），705（1H，s，H8），556（1H，d，J=140 Hz，H10），677（1H，d，J=18 Hz，H2′），603（2H，s，3′，4′OCH2O），694（1H，d，J=78 Hz，H5′），674（1H，dd，J=78，18 Hz，H6′）； 13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1365（C1），1300（C2），1195（C3），1464（C4），1276（C4a），1016（C5），1527（C6），1497（C7），1105（C8），1323（C8a），1726（C9），687（C10），1025（OCH2O），1302（C1′），1115（C2′），1488（C3′，C4′），1089（C5′），1246（C6′），563（OCH3），1126（Cl″），788（C2″），803（C3″），759（C4″），643（C5″）。以上以上波譜数据与文献[6] 报道的化合物基本一致，故鉴定该化合物为（-）haplomyrtoside。

4活性测试

抗流感病毒（A/Hanfang/1/47，H5N1）试验方法：在5% CO2，37 ℃条件下，将MDCK 细胞接种于96 孔培养板内。24 h后使MDCK细胞感染流感病毒1×10-5，吸附2 h后弃掉病毒液，再加入含有不同稀释度样品及阳性对照药（奥司米韦）的维持液。在5% CO2，37 ℃条件下继续培养，待病毒对照组病变（CPE）达4+时观察各组细胞病变（CPE）（约35 h），计算各样品抗流感病毒半数抑制浓度（IC50）。结果表明化合物1，3，4，5具有较强的抗流感病毒（H5N1）活性，IC50分别为065，021，032，056 μmol·L-1，SI分别为125，35，106，78； 阳性对照药（奥司米韦）IC50为28 μmol·L-1 ，SI为1 1501。

细胞毒活性试验方法：用含10%小牛血清的RPMI1640培养基配制成1万个/mL细胞悬液，将肿瘤细胞置于培养液中。96孔培养板内接种细胞，在37 ℃，5% CO2温箱内培养24 h。受试样品设3个浓度（01，1，10 μmol·L-1），每个浓度设置3个平行孔，在37 ℃，5% CO2温箱内培养4 d。弃去培养液后，每孔加入MTT 溶液（04 g·L-1，RPMI1640 配制）100 μL，37 ℃ 孵育4 h。弃上清液，每孔加入DMSO 150 μL，用550型酶标仪在检测波长540 nm，参考波长405 nm下测定A。结果表明化合物1，2，6，7具有较好的抗人肝癌细胞（HepG2）活性，IC50分别为035，025，053，066 μmol·L-1，阳性对照药紫杉醇IC50为0012 μmol·L-1。

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[責任编辑丁广治]