星点设计—响应面法优选五味子的二次提取工艺

2018-11-27叶殷殷李岩李子行曹智启

中国当代医药 2018年23期

叶殷殷李岩李子行曹智启

[摘要]目的分别采取星点设计-响应面法对五味子的两次提取工艺进行优选。方法采用UV法于278 nm波长处测定木脂素含量，以木脂素含量为因变量，乙醇浓度、提取时间和溶剂倍量为自变量，采用星点设计-响应面法依次优选五味子2次提取工艺。结果第一次提取的最佳提取工艺为：10倍药材量的70%乙醇回流提取五味子70 min，二项式拟合复相关系数为r=0.8900，提取率实际值比预测值大；第二次提取以10倍药材量的70%乙醇回流提取五味子40 min，二项式拟合复相关系数为r=0.8445，验证试验所得木脂素平均值为8.953 mg/g，真实值与预测值偏差为2.0%。结论分次进行星点设计-响应面法优选所得的五味子提取工艺预测性好，缩短了提取的时间，降低生产成本。

[关键词]星点设计-响应面法；二次提取；木脂素；五味子醇甲

[中图分类号] R283.6 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2018）8（b）-0008-05

Optimization of the secondary reflux extraction process of Schisandrae Chinensis Fructus by central composite design-response surface methodology

YE Yin-yin LI Yan LI Zi-hang CAO Zhi-qi

Lingnan Institute of Technology， Guangdong Province， Guangzhou 510663， China

[Abstract] Objective To optimize secondary extraction processes of Schisandrae Chinensis Fructus through the central composite design-response surface methodology. Methods The content of lignan was determined by Ultraviolet spectrophotometry at the wavelength of 278 nm. The content of lignin as dependent variable， ethanol concentration， extraction time and solvent times as independent variables， the secondary extraction processes of Schisandrae Chinensis Fructus was optimized by central composite design-response surface methodology. Results The first extraction process was optimized as follow： extracted Schisandrae Chinensis Fructus for 70 min with 10 times， the amount of crude drugs and the volumes of 70% ethanol. The binomial fitting complex correlation coefficient was r=0.8900， and the actual value of extraction ratio was larger than the predicted. The second extraction process was optimized as follow： extracted Schisandrae Chinensis Fructus for 40 min with 10 times the amount of crude drugs and the volumes of 70% ethanol. The correlation coefficient of binomial fitting was r=0.8445. The average value of lignans obtained from the verification test was 8.953 mg/g， and the deviation between the true value and the predicted value was 2.0%. Conclusion The central composite design-response surface methodology is preferred， and the obtained Schisandra extraction process has good predictability， shortens the extraction time， and reduces the production cost.

[Key words] Central composite design-response surface methodology； Secondary extraction； Lignin； Schizandrin

五味子是一種木兰科植物，具有性温、甘及味酸等特点，归肺、肾、心经，能够发挥出收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效，临床用于治疗久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠[1]。其主要的有效成分木脂素经药理研究表明，有镇静、催眠、抗衰老、抗氧化的作用[2]。目前对于木脂素的提取工艺研究往往只针对第一次提取的工艺进行研究，如李平等[3]考察了五味子的一次提取工艺，欧阳小光等[4]直接提取两次，以合并后的提取液中木脂素含量为指标考察五味子的提取工艺。而分别对两次提取工艺进行考察的研究鲜有报道，然工业生产多为二次提取，第二次提取所用的乙醇浓度、溶剂用量、提取时间的多少亦会影响整个工业生产周期的成本，故为了更好地服务于工业生产，降低工业生产成本，本研究以木脂素为含量测定指标，通过星点设计-响应面法研究木脂素二次提取工艺，以期改善回流提取工艺，给工业生产提供可靠有效的数据参考依据，现报道如下。

1仪器、试剂与试药

1.1仪器与试剂

UNICO2350型紫外-可见分光光度计（上海尤尼克有限公司）；FA1004万分之一电子天平（上海恒平）；AUW220D十万分之一电子天平（日本岛津）；KQ-50B超声清洗器（昆山舒美）；Design Expert 10.0统计软件；所用水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。

1.2试药

五味子醇甲（江苏永健生物科技有限公司，161011-160725）；五味子（北京同仁堂，20170821），经广东岭南职业技术学院中药教研室鉴定符合《中国药典》（2015年版）五味子项下规定，为木兰科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.的干燥果实。

2方法与结果

2.1含量测定

2.1.1对照品溶液的制备取34.2 mg的五味子醇甲对照品，精密称定，置于50 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀释成每毫升含五味子醇甲0.342 mg的溶液，精密量取5 ml，置20 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得浓度为0.0855 mg/ml的对照品溶液。

2.1.2提取浓缩液的制备称取五味子药材5.0 g，加80%乙醇进行加热回流提取，提取时间为60 min滤过，滤液回收乙醇并定容至20 ml，即得提取浓缩液。

2.1.3供试品溶液的制备精密量取“2.1.2项”下所得提取浓缩液5 ml，置100 ml具塞锥形瓶中，加甲醇25 ml，精密称定，于超声清洗器中提取30 min，取出，精密称定，加甲醇补足重量，滤过，精密量取续滤液1 ml，置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得供试品溶液。

2.1.4标准曲线的绘制取0.342 mg/ml的对照品溶液1、2、5、10、15 ml，分别置于20 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，在波长278 nm处对吸光度（A）予以测定，以吸光度作为纵坐标，木脂素浓度（C）则作为横坐标，将标准曲线绘制出，得到回归方程：A=7.0322C-0.0004，r=0.9991（图1）。本研究结果提示，木脂素含量为0.0171～0.256 mg/ml，与吸光度之间的线性关系良好。

图1 五味子中木脂素的标准曲线图

2.1.5精密度试验精密量取“2.1.2项”下所得同一提取浓缩液，按“2.1.3项”下方法制备，于278 nm波长处连续测定吸光度值6次，所得A值分别为0.583、0.584、0.582、0.583、0.583、0.582，RSD=0.13%，提示仪器精密度良好。

2.1.6稳定性试验精密量取“2.1.2项”下所得同一提取浓缩液，按“2.1.3项”下方法制备，于278 nm波长处分别测定0、2、4、8、16、24 h时供试品的吸光度，计算含量，所得结果为1.860、1.857、1.843、1.830、1.821、1.805 mg/g，RSD=1.2%，提示供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.7重复性试验精密量取“2.1.2项”下所得同一提取浓缩液，按“2.1.3项”下方法制备6份供试品溶液，于278 nm波长处测定吸光度，同时对含量进行计算，所得结果为1.80、1.82、1.83、1.83、1.81、1.84 mg/g，RSD=1.0%，提示该方法具有良好的重复性。

2.1.8加样回收试验精密量取2.5 ml已知提取率的提取液6份，分别加入已稀释至等量浓度的对照品溶液2.5 ml，按“2.1.3項”下方法制备供试品溶液，于278 nm波长处测定吸光度，计算平均回收率为100.5%，RSD=1.6%（表1）。

2.2单因素考察试验

称取五味子药材5.0 g，采用加热回流提取的方法，在回流提取温度为90℃的条件下，分别从乙醇浓度、提取用时、溶剂倍量三个方面进行单因素考察。

2.2.1乙醇浓度的考察规定提取时间为60 min，乙醇倍量为10倍，分别考察乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%时木脂素的提取率，结果提示，当乙醇浓度为70%时，木脂素提取率最高，故选择70%作为中间水平。

2.2.2提取用时的考察规定乙醇倍量为10倍，提取浓度为60%，分别考察提取时间为10、20、40、60、80、100 min时木脂素的提取率，结果提示，当提取时间为40 min时，木脂素提取率最大，故选择40 min作为中间水平。

2.2.3溶剂倍量的考察规定提取时间为60 min，提取浓度为60%，分别考察溶剂倍量为6、8、10、12、14倍时木脂素的提取率，本研究结果提示，当溶剂倍量为10倍时，木脂素提取率最高，故选择10倍量作为中间水平。

2.3星点设计试验

2.3.1第一次提取试验依照单因素考察的结果，选取乙醇进行回流提取。将连续变量乙醇浓度（X1）、溶剂倍量（X2）以及提取用时（X3）作为考察因素进行三因素-五水平的星点设计（表2）。分别称取五味子5.0 g，按表2进行星点设计试验，加热回流提取的提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩定容成20 ml，精密量取5 ml，按“2.1.3项”下方法制备供试品溶液，测定吸光度并计算含量（mg/g）（表3）。

2.3.2模型拟合采用Design Expert 10.0，以木脂素含量（mg/g）作为因变量对各因素进行多元线性回归分析，经二项式拟合，获得拟合模型。其中多元线性回归方程为：Y=1.529-0.006X1+0.050X2+0.042X3，r=0.372，F（3，11）=0.857，P=0.0483，线性模型拟合度不好，采用二项式拟合，结果为：Y=-63.12+1.49X1+1.97X2+0.25X3+0.002436X1X2+0.00009998X1X3-0.013X2X3-0.011X12-0.079X22-0.001119X32。复相系数r=0.8900，F=6.07，差异有统计学意义（P<0.0001），对比线性拟合，明显提高了拟合度，提示方程具有较高的可信度。

2.3.3第一次提取工艺参数的预测及优化将因变量和另外两个因素拟合成三维曲面图，由于仅能将两个因素变量函数表达出，因此固定三个变量中其中一个作为中值，接着将拟合目标函数作为数学模型，并绘制因变量曲面图（图2、3、4）。

研究结果提示，在适宜的提取时间下，乙醇浓度60%～70%、溶剂倍量9～11倍时能获得较理想的提取效果。在溶剂倍量适宜时，乙醇提取浓度60%～70%、提取用时23～40 min时可获得较佳的提取效果。乙醇提取浓度保持在一定状态时，溶剂倍量8～10倍、提取用时23～40 min时能得到较理想的提取效果。由于模型中实际所得数据比预测值要大，故以实际所得值为第一次提取的最佳工艺：X1为70%，X2为10倍，X3为70 min。

2.3.4第二次提取試验由于第二次提取选用的考察因素与考察指标与第一次提取一致，且为了便于将2次提取合并液的星点设计所得含量进行比较，故不再进行单因素试验，仍选择以第一次提取的因素设计水平一致。以连续变量乙醇浓度（X1）、溶剂倍量（X2）、提取用时（X3）为考察因素进行三因素-五水平的星点设计（表5）。分别称取五味子药材5.0 g，先按第一次提取的最佳工艺加热回流提取20份，滤过，取滤渣按表5的星点设计试验进行加热回流提取，得提取液，滤过，滤液回收乙醇并浓缩至20 ml，按“2.1.3项”下方法制备供试品溶液，测定吸光度并计算含量（mg/g）（表6）。

2.3.5模型拟合采用Design Expert 10.0专业统计分析软件，以木脂素含量为因变量对各因素进行多元线性回归，经二项式拟合，获取拟合模型。多元线性回归如下：Y=0.830+0.006X1+0.037X2+0.019X3，r=0.414，F（3，11）=1.104，P=0.377，线性模型拟合度不好，采用二项式拟合，结果为Y=-21.21+0.41X1+1.19X2+0.14X3+0.0003499X1X2-0.014X1X3-0.003059X2X3-0.032X12-0.079X22-0.00003783X32。复相系数r=0.8445，F=2.76，差异无统计学意义（P>0.05），与线性拟合比较，拟合度有一定程度的提高，提示方程可信度高。

2.3.6第二次提取工艺参数的优化预测因变量与另外两个因素拟合成三维曲面图，由于仅能表达含两个因素变量的函数，所以将三变量中的一个固定为中值，其后再将拟合目标函数作为数学模型，最后绘制因变量曲面图（图5～7）。待消耗一定提取时间后，研究结果提示，乙醇、溶剂倍量为8～10倍、浓度60～70%时提取效果比较理想。在保持一定溶剂倍量时，乙醇提取时间40～60 min，浓度范围为60～70%时，提取效果较佳。在维持一定乙醇提取浓度时，提取时间40～60 min，溶剂倍量8～10倍时，提取效果较佳。基于2次提取时的成本问题，故认为第二次提取的最佳工艺：X1为70%，X2为10倍，X3为40 min。

2.3.7验证试验分别取3份五味子药材5.0 g，精密称定，第一次提取加入10倍量的70%乙醇加热回流提取70 min，滤过，取滤渣加入10倍量70%乙醇回流提取40 min，滤过，合并滤液，回收乙醇至25 ml，按“2.1.2项”下方法制备供试品溶液，测定吸光度并计算含量（mg/g），得木脂素含量分别为8.832、9.009、9.017 mg/g，平均为8.953 mg/g，RSD=1.2%，与真实工艺所得值进行比较，所得木脂素含量为9.034、9.175、9.192 mg/g，平均为9.136 mg/g，RSD=0.95%，真实值与预测值偏差为2.0%，提示建立的数学模型有良好的预测性，此项工艺条件可行高，稳定性佳。

3讨论

研究提示，五味子所含木脂素类成分可以有效地缩短潜睡期，改善人体睡眠并能有效抑制肿瘤细胞[5-9]。对于木脂素类成分的提取方法有水提取、乙醚提取和超声提取等，因木脂素类成分在乙醇中溶解度要大于在水中的溶解度，且乙醇本身毒性小，加之超声提取在工业大生产中限制较多，故本研究采用乙醇加热回流提取。而对于这些方法的考察多采用正交设计或者均匀设计，由于正交设计对各因素之间相互作用的考虑不足，近些年，国内学者将星点设计-响应面法广泛应用于中药制剂的制备工艺优化和质量控制中[10-18]，相比均匀设计法与正交设计法，星点设计法获得的结果更具有直观性，有助于分析，还可使精确度得到提高[19]。李平等[3]运用了星点设计-响应面法考察了乙醇浓度、溶剂倍量、提取用时对木脂素提取率的影响，但只考察了1次提取率，魏殿文等[20]采用响应面法对五味子的超声提取工艺进行研究，认为其最佳提取工艺为乙醇浓度95%、液固比16∶1、超声时间25.5 min，五味子木脂素浓度5.16%。料液比和乙醇浓度较大增加了生产成本，本研究采用星点设计-响应面法分别对两次提取进行了工艺考察，并通过比较预测值和真实值，获得最佳工艺模型，后期参照《中国药典》（2015年版）五味子含量测定项下内容对提取液中五味子醇甲含量进行测定，其含量>0.4%，符合药典的规定，提示该试验能够满足生产的要求，为工业化生产提供参考数据。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：66-67.

[2]周燕燕.五味子的现代药理作用研究进展[J].海峡药学，2016，28（3）：183-184.

[3]李平，李小芳，向志云，等.星点设计-效应面法优化五味子木脂素的提取工艺[J].中药与临床，2016，7（2）：38.

[4]欧阳小光，杨璐.星点设计-效应面法优选五味子提取工艺[J].中国中医药信息杂志，2012，4（19）：59.

[5]刘艳杰，项荣武.星点设计效应面法在药学试验设计中的应用[J].中国现代应用药学杂志，2007，24（6）：455-457.

[6]银萍，王博，刘兴医，等.Box-Behnken响应曲面法优化五味子木脂素的提取工艺[J].江苏农业科学，2017，45（22）：210-212.

[7]王晗，刘聪，敬舒，等.五味子淫羊藿混合物提取工艺及其抗疲劳作用研究[J].北华大学学报（自然科学版），2017， 18（3）：321-325.

[8]张悦怡，赵岩，刘勇慧，等.五味子种子木脂素超声提取工艺的优化[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2015， 43（6）：215-220.

[9]唐静，金利华，李英英，等.响应曲面法优化南五味子多糖的提取工艺[J].化学与生物工程，2017，34（10）：49-53.

[10]田双，严铭铭，邵帅，等.五味子醇提物的提取工艺优化及其体外抗氧化作用评价[J].中国药房，2016，27（28）：3976-3978.

[11]李化，柯华香，李发洁，等.Box-Behnken响应面法优选五味子多糖双水相提取工艺[J].中药材，2016，39（3）：593-597.