胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤后TLR4、NF-κB及I-κB表达的影响*

陈红兵　赵　磊　刘一民（山东省潍坊市益都中心医院，山东潍坊262500）



胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤后TLR4、NF-κB及I-κB表达的影响*

陈红兵△赵磊刘一民
（山东省潍坊市益都中心医院，山东潍坊262500）

【摘要】目的观察胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤后Toll样受体4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）及核因子-κB抑制剂（I-κB）表达的影响。方法选取成年雌性健康大鼠72只，从中随机选择12只为空白对照组，其余60只大鼠采用线栓法建立大脑中动脉脑缺血再灌注损伤的模型。选取建模成功的36只大鼠，采用随机数字表法分为胡黄连苷Ⅱ治疗组、阳性对照组以及阴性对照组，每组12只。胡黄连苷Ⅱ治疗组大鼠给予胡黄连苷Ⅱ注射干预，阳性对照组大鼠给予丹参素钠干预，空白对照组和阴性对照组给予磷酸盐缓冲液（PBS）干预。采用TUNEL染色方法检测3组大鼠的细胞凋亡情况；采用免疫组织化学染色方法检测各组大鼠脑内TLR4、NF-κB及I-κB表达的情况。结果空白对照组大鼠的TUNEL阳性细胞呈散在分布、数量较少，大鼠的海马组织、纹状体、大脑皮质中TLR4、NF-κB及I-κB的表达较微弱；阴性对照组大鼠的TUNEL阳性细胞比空白对照组大鼠的数量显著增加，海马组织、纹状体、大脑皮质中TLR4、NF-κB及I-κB的表达较空白对照组显著增加（P＜0.05）；胡黄连苷Ⅱ治疗组以及阳性对照组大鼠TUNEL阳性细胞数、不同脑组织中TLR4、NF-κB及I-κB的表达均较阴性对照组大鼠低（P＜0.05），组间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论对脑缺血再灌注损伤大鼠来说，给予胡黄连苷Ⅱ治疗可以下调大鼠TLR4、NF-κB及I-κB的表达，显著的抑制大鼠的炎症反应，抑制神经细胞的凋亡。

【关键词】胡黄连苷Ⅱ脑缺血再灌注损伤TLR4 NF-κB I-κB

在脑缺血再灌注损伤中，炎症反应发挥着重要的作用。Toll样受体（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）及核固子-κB抑制剂（I-κB）在脑缺血再灌注损伤的炎症反应中，能够通过相应的途径诱导神经细胞的凋亡［1］。而相关研究表明，胡黄连苷Ⅱ可以抑制神经细胞的凋亡［2］。本研究观察了胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血再灌注损伤后TLR4、NF-κB及I-κB表达的影响。现报告如下。

1　材料与方法

1.1动物及分组选取成年雌性健康Wistar大鼠72只，体质量240~260 g。在开始试验前，将72只大鼠提前1周放入实验室，使大鼠能够适应周围的环境；实验室的温度在23~25℃，给予大鼠自然光照、自由饮水、自由进食，在相关方法干预前12 h禁食。从中随机选择12只为空白对照组，其余60只大鼠采用线栓法建立大脑中动脉脑缺血再灌注损伤的模型（缺血2 h，再灌注22 h）。选取建模成功的36只大鼠，采用随机数字表法分为胡黄连苷Ⅱ治疗组、阳性对照组以及阴性对照组，每组12只。

1.2实验方法干预措施，在大鼠缺血2 h后，再灌注之前22 h进行药物干预。胡黄连苷Ⅱ治疗组给予胡黄连苷Ⅱ注射，剂量为250 μL（10 mg/kg）；阳性对照组给予丹参素钠干预，剂量为250 μL（10 mg/kg）；空白对照组和阴性对照组给予磷酸盐缓冲液（PBS）干预。制备石蜡切片，从每组大鼠中分别选取6只，先用0.3 mL、10%的水合氯醛进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定大鼠。分别使用250 mL的0.9%氯化钠注射液、4%的甲醛溶液进行灌注处理，之后取出大鼠脑组织放于4%的甲醛溶液进行固定，时间为2 h，固定后使用蒸馏水进行浸泡，时间为4 h。浸泡后使用梯度酒精进行脱水处理，二甲苯透明化，石蜡包埋。从大鼠的视交叉后进行冠状位切片处理，厚度为5 μm，将切取的组织置于载玻片上备用。TUNEL染色方法检测细胞凋亡，将切片进行常规脱蜡、水化、灭活处理，将新鲜稀释的ProteinaseK在37℃下进行消化处理，PBS冲洗3次；滴加适量标记缓冲液后将切片置于湿盒中，在37℃的温度下标记2 h，PBS冲洗3次。加入封闭液，在室温中约30 min后将封闭液甩去，加入稀释过的抗地高辛抗体后，将切片置于湿盒中，在37℃下反应30 min，PBS冲洗3次。取蒸馏水1 mL，将试剂盒中的3种试剂分别滴1滴至切片上，在室温下进行显色。终止反应时，可以使用蒸馏水进行洗涤处理，并用梯度酒精进行脱水，使用二甲苯进行透明之后封片。将切片放置于荧光显微镜下进行观察，记录阳性细胞的数量。免疫组化染色，切片给予常规脱蜡、水化、染色，最后将切片置于显微镜下进行观察。

1.3观察指标采用TUNEL染色方法检测3组大鼠的细胞凋亡情况；采用免疫组织化学染色方法检测3组大鼠脑内TLR4、NF-κB及I-κB表达的情况。凋亡细胞判定：显微镜下细胞的细胞核中出现黄褐色或者棕黄色的颗粒即为阳性。

1.4统计学处理应用SPSS 20.0统计软件分析。计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料采用率表示，采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠凋亡细胞的数量比较见表1。胡黄连苷Ⅱ治疗组以及阳性对照组大鼠TUNEL阳性细胞数的表达均较阴性对照组大鼠低，差异有统计学意义（P＜0.05），但是此两组相比较差异无统计学意义（P> 0.05）。

表1　各组不同脑组织区域的TUNEL阳性凋亡细胞数比较（±s）

表1　各组不同脑组织区域的TUNEL阳性凋亡细胞数比较（±s）

与阴性对照组比较，*　P＜0.05，**　P＜0.01。下同。

组别　n　海马区皮质区　纹状体区空白对照组　6　2.22±1.14阴性对照组　611.31±2.23阳性对照组　6　5.22±1.82*　 3.52±1.12　 2.91±1.62 16.63±3.24 10.31±3.05 8.14±2.14*　6.11±2.30*　胡黄连苷Ⅱ治疗组　6　5.14±1.45*　 7.65±2.07*　6.13±2.45*

2.2各组大鼠脑组织各区TLR4阳性细胞结果比较

见表2。胡黄连苷Ⅱ治疗组以及阳性对照组大鼠TLR4阳性细胞数的表达均较阴性对照组大鼠低，差异有统计学意义（P＜0.05），但是此两组相比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表2　各组不同脑组织区域的TLR4阳性细胞数比较（±s）

表2　各组不同脑组织区域的TLR4阳性细胞数比较（±s）

组别　n　海马区皮质区　纹状体区空白对照组　6　0.18±0.05阴性对照组　6　0.40±0.14阳性对照组　6　0.26±0.11*　 0.16±0.06　 0.22±0.08 0.45±0.17　 0.39±0.15 0.24±0.12*　 0.25±0.09*　胡黄连苷Ⅱ治疗组　6　0.21±0.08*　 0.25±0.12*　 0.24±0.07*

2.3各组大鼠脑组织各区NF-κB及I-κB表达情况

见表3。胡黄连苷Ⅱ治疗组以及阳性对照组大鼠NF-κB及I-κB阳性细胞数的表达均较阴性对照组大鼠低，差异有统计学意义（P＜0.05），但是此两组相比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3　讨　论

机体对缺氧最敏感的器官组织就是脑，脑的缺血、缺氧会导致其不可逆的功能损害，严重者还会发生梗死，严重的威胁着机体的生命健康，所以需要及时地恢复脑血流。但是，脑组织的缺血再灌注也会导致严重的损害。随着缺血再灌注时间的延长，体内的兴奋性氨基酸含量逐渐降低，抑制性氨基酸含量逐渐升高，脑细胞会发生相应的结构改变，例如：线粒体的肿胀、染色体的凝集、微血栓的形成等，给机体带来不同程度的损害［3-4］。

表3　两组NF-κB及I-κB阳性细胞表达情况比较（±s）

表3　两组NF-κB及I-κB阳性细胞表达情况比较（±s）

NF-κB　I-κB皮质区　纹状体区　海马区　皮质区　纹状体区　海马区空白对照组　6 0.15±0.07 0.13±0.05 0.17±0.04　 0.14±0.04 0.13±0.06 0.15±0.03阴性对照组　6 0.57±0.16 0.54±0.20 0.55±0.15　 0.40±0.14 0.39±0.15 0.41±0.13阳性对照组　6 0.26±0.14*　0.23±0.12*　0.22±0.11*　0.26±0.09*　0.24±0.08*　0.27±0.10*　胡黄连苷Ⅱ治疗组　6 0.24±0.07*　0.21±0.11*　0.24±0.10*　0.23±0.10*　0.21±0.09*　0.22±0.09*　组别　n

本研究在对大鼠进行治疗干预时发现，对缺血再灌注损伤比较敏感的大鼠其皮质、纹状体、海马部位的TLR4、NF-κB、I-κB的表达明显高于空白对照组大鼠，说明了大鼠体内的损伤因子通过使TLR4、NF-κB、I-κB的表达增加，激活体内的炎症反应，导致神经凋亡细胞的增加。而注射胡黄连苷Ⅱ的大鼠，其各项指标均比阴性对照组降低。出现这种结果的原因为：TLR4通过与接头蛋白结合、与白介素相关激酶结合，可以促进相关核转录因子如NF-κB的移位，从而启动与炎症反应、非特异性免疫相关基因的转录，最终导致炎症的发生。脑缺血再灌注损伤时，会使大鼠的非特异性免疫系统激活，同时激活TLR4- NF-κB信号转导通路、I-κB激酶，使I-κB上的丝氨酸残基发生泛素化与磷酸化。最终诱发炎症反应，导致相关指标的升高。

TLR4是Toll样受体的一种，在机体的非特异性免疫中发挥着重要的作用［5］。NF-κB是一组二聚体的转录因子，属于Rel蛋白家族，可以调控细胞凋亡、炎症、免疫反应等相关基因的表达［6-8］。研究表明，NF-κB在炎症反应以及免疫反应中占据重要的地位［9］。NF-κB二聚体可以是同源性二聚体或者异源性二聚体，由多肽链p65及p50组成［10］。NF-κB异源性二聚体的活性比较强，通过与抑制因子I-κB的结合，可以形成一个没有活性的三聚体并存在于细胞质中［11-12］。I-κB家族中一共有7个成员，其中其主要作用的为I-κBα。之后泛素化的I-κB会在蛋白酶的作用下降解，导致NF-κB进入到细胞核内，通过与特定的DNA序列相结合，使相应的基因转录以及蛋白质的翻译，并形成正反馈导致炎症反应的持续发生［13-15］。

综上所述，胡黄连苷Ⅱ治疗可以下调大鼠TLR4、NF-κB及I-κB的表达，显著地抑制大鼠的炎症反应，抑制神经细胞的凋亡。

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Effects of PicrosideⅡon the Expression of TLR4，NFκB and I-κB in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion Injury

CHEN Hongbing，ZHAO Lei，LIU Yimin.
Yidu Central Hospital of Weifang，Shandong，Weifang 262500，China.

【Abstract】Objective：To discuss the effects of picrosideⅡon the expression of TLR4，NFκB and I-κB in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury. Methods：72 cases of healthy adult female rats were chosen，from which，12 cases were randomly selected as the blank control group，and the rest of the 60 rats were established as middle cerebral artery ischemia-reperfusion injury model with suture method. 36 rats of successful model were selected and randomly divided into 3 groups：the picrosideⅡtreatment group，the positive control group and the negative control group（12 cases in each）with random number table method. The picrosideⅡtreatment group was given picrosideⅡinjection intervention，the positive control group danshensu sodium intervention，the blank control group and negative control group phosphate buffer（PBS）intervention. Apoptosis of the above groups were observed with TUNEL staining method. The expression of TLR4，NFκB and I-κB were observed with immunohistochemical staining method. Results：TUNEL-positive cells of blank control group were scattered，small number，and the expression of TLR4，NFκB and I-κB in hippocampal tissue，striatum，cerebral cortex were relatively weak；TUNEL-positive cells of negative control group significantly increased than the blank control group，and the expression of TLR4，NF-κB and I-κB in hippocampal tissue，striatum，cerebral cortex significantly increased compared with the control group（P＜0.05）；TUNEL-positive cells and the expression of TLR4，NF-κB and I-κB of picrosideⅡtreatment group，positive control group were lower than those in the the negative control group（P＜0.05），but there was no statistically significant difference between the two groups（P＞0.05）. Conclusion：For the rats with cerebral ischemia reperfusion injury，picrosideⅡtreatment can cut the expression of TLR4，NF-κB andI-κB，and significantly inhibit the inflammatory response in rats and neuronal apoptosis.

【Key words】PicrosideⅡ；Cerebral ischemia-reperfusion injury；TLR4；NF-κB；I-κB

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）02-0242-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.02.017

*基金项目：山东省潍坊市卫生局科研项目计划（2014007）

通信作者△（电子邮箱：chb0536@aliyun.com）

收稿日期（2015-11-27）