偏苯三酸三辛酯对肝细胞的毒性作用及其机制

陈献花, 方 丽, 李雪来, 余陈欢, 应华忠(. 浙江省医疗器械检验院, 浙江省医疗器械安全性评价研究重点实验室, 杭州 3008; . 浙江省医学科学院, 浙江省实验动物与安全性评价重点实验室, 杭州 3003)



偏苯三酸三辛酯对肝细胞的毒性作用及其机制

陈献花1, 方 丽1, 李雪来1, 余陈欢2, 应华忠2
(1. 浙江省医疗器械检验院, 浙江省医疗器械安全性评价研究重点实验室, 杭州 310018; 2. 浙江省医学科学院, 浙江省实验动物与安全性评价重点实验室, 杭州 310013)

[摘要]目的 研究偏苯三酸三辛酯(TOTM)的肝细胞毒性作用及其毒性机制。方法 将TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL分别与HepG2、LO2、Hep1-6肝细胞作用48 h。采用MTT法检测细胞存活率并计算半抑制浓度(IC50)值; 倒置显微镜观察细胞形态变化; 采用试剂盒检测细胞培养液中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)含量; 采用流式细胞技术检测细胞凋亡情况。结果 TOTM对肝细胞增殖有明显的抑制作用，MTT检测显示TOTM对HepG2、LO2、Hep1-6肝细胞的IC50分别为1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。随着TOTM剂量的增加，TOTM能升高肝细胞上清中AST、ALT含量, 促进LDH释放和细胞凋亡。结论 TOTM对肝细胞具有一定的毒性作用。

[关键词]偏苯三酸三辛酯; 肝细胞; 细胞凋亡

偏苯三酸三辛酯(TOTM)是目前常用的新型塑化剂之一，目前被广泛应用于生产耐热和耐压的输注类医疗器械等产品[1]。现有文献[2,3]报道，由于部分药物、辅料的助溶作用，微量TOTM可从聚氯乙烯、硝酸纤维素等材料制成的输液软管中渗出并伴随注射液进入体内。虽然TOTM较其他塑化剂具有生物体内代谢快、毒性低、低浸出等优点，但其潜在的遗传和生殖毒性仍不可忽视[4]。肝脏是体内最主要的药物代谢器官，静脉输送药物进入体内后大部分在肝脏代谢、分解。项目组前期研究显示, 每日给小鼠尾静脉注射100mg/kg, TOTM[欧洲化学品管理局(ECHA)标示的无可见有害作用水平(NOAEL)剂量]可引起小鼠肝组织细胞脂质堆积和部分细胞坏死，并可导致丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血脂等生化指标升高。但目前关于TOTM对肝细胞的半数抑制剂量及其作用机制尚不清楚[5]。因此，本实验通过体外实验，对TOTM的肝细胞毒性进行深入评价，以完善TOTM的安全评估体系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

TOTM购自上海阿拉丁试剂有限公司; RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)均购自杭州四季青生物制品有限公司; AST、ALT检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所; AnnexinV /PI 双染细胞凋亡检测试剂盒细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物技术股份有限公司。FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。Thermo311二氧化碳恒温培养箱为美国热电公司产品。

1.2 细胞

HepG2人肝癌细胞、LO2人正常肝细胞、Hep1-6小鼠肝癌细胞均购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。

1.3 细胞培养

HepG2、LO2和Hep1-6细胞分别独立培养于含10% FBS的RPMI 1640培养液中, 置 37 ℃、体积分数5% CO2及饱和湿度下细胞培养箱中培养，用0.25%胰蛋白酶液消化、传代，取状态良好、增殖旺盛的细胞用于本试验。

1.4 TOTM供试样品的制备

取TOTM 500 mL溶解在484 mL 二甲基亚砜(DMSO)中配制成 500 mg/mL的储存液。将储存液用培养基配制成不同浓度(即培养基中TOTM的终浓度为0.062 5 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)，其中DMSO的最终质量分数均小于1‰。

1.5 MTT 法检测细胞增殖活性

选对数生长期细胞, 用质量分数0.25%胰蛋白酶消化、收集, 将细胞浓度调整为1.0×104/mL。将细胞悬液接种于96孔板, CO2孵育箱中培养12 h, 加入TOTM使其终浓度为0.062 5 mg/mL、0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL。平行设置对照孔(不加药)，置37 ℃、体积分数5%CO2孵育箱中培养48 h。取出培养板，每孔加入5 mg/mL的MTT 10mL, 混匀, 继续培养2 h, 弃去上清液，每孔加入100 mL DMSO，震荡10 min使结晶充分溶解，用酶标仪于波长490 nm测每孔吸光度OD值，检测细胞增殖情况。

1.6 细胞凋亡率测定

将浓度为1×105/mL的LO2细胞, 接种于6孔板中。加TOTM至各孔(终浓度为0.34 mg/mL)。平行设置对照组, 药物作用48 h, 收集、消化后，加 PBS, 800 r/min离心5 min 洗 2 次, 计数; 稀释成每毫升约1×105细胞, 转入流式细胞管, 加入Annexin V- FITC和Propidium Iodide各5 mL，混匀，室温避光孵育 15 min，用流式细胞仪测量细胞凋亡率。

1.7 细胞形态学观察

取灭菌后的盖玻片放入无菌6孔板中，接种LO2细胞，待细胞生长至70%时，弃去旧的培养液，将不同浓度的含药培养液加到相应的孔中，培养48 h后，取出盖玻片，倒置显微镜下观察并拍照记录细胞的形态学变化。

1.8 乳酸脱氢酶(LDH)、AST及ALT含量测定

调整为1.0×105/mL的LO2细胞悬液，于CO2孵育箱中培养24 h，弃上清液，加TOTM(终浓度为0.34 mg/mL)。平行设置对照组，培养48 h，收集细胞。按照试剂盒说明书，用酶标仪测定LDH、AST及ALT含量。

1.9 统计学处理

数据用SPSS 13.0统计软件处理，各组定量检测数据以x-± s表示，组间比较用LSD 检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TOTM对肝细胞增殖的抑制作用

TOTM对HepG2、LO2、Hep1-6细胞增殖有明显抑制作用，并呈现量效关系(图1)。经计算，TOTM对HepG2、LO2、Hep1-6肝细胞的半抑制浓度 (IC50) 分别为1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。提示Hep1-6小鼠肝癌细胞和LO2人正常肝细胞对TOTM相对HepG2人肝癌细胞较为敏感。故后续实验以LO2细胞为研究对象。

图1 TOTM对肝细胞增殖的抑制作用

2.2 TOTM对LO2细胞形态学的影响

倒置显微镜下，对照组细胞分界清楚、表面光滑, 细胞形态未见明显异常。0.25 mg/mL TOTM组，开始有少部分细胞失去正常的形态，出现细胞变圆现象; 0.5 mg/mL TOTM组部分细胞变圆，出现形态模糊、分界不清; 1.0 mg/mL TOTM组明显可见大量细胞变圆，皱缩，表面粗糙。提示高剂量TOTM可明显导致肝细胞形态改变。

2.3 TOTM对LO2细胞凋亡的影响

由流式细胞分析结果可知，0.25～1.0 mg/mL 的TOTM可诱导细胞凋亡，凋亡率分别为7.4% ± 1.0%，11.6%±1.5%和18.5%±1.9%，明显高于对照组(2.4%±0.3%)(P<0.05)。并随着TOTM浓度的增加，细胞凋亡率越高。

2.4 TOTM对LO2细胞培养液AST、ALT和LDH含量的影响

由表1可知, TOTM与LO2肝细胞作用48 h后，与对照组相比，细胞培养液中ALT和AST活性明显升高; TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL剂量组AST活性显著升高(P<0.05)，而TOTM 0.125～1.0 mg/mL剂量组ALT活性显著升高(P<0.05)，具有一定的量效关系。另一方面，TOTM 0.062 5～1.0 mg/mL剂量作用LO2肝细胞作用48 h后，细胞培养液中LDH水平显著增加, 与对照组比较有显著性差异(P<0.05),提示TOTM可造成肝细胞膜损伤，膜通透性增加，进而增加LDH释放。

图2 TOTM对LO2细胞形态的影响

表1 TOTM对LO2细胞培养液AST、ALT和LDH含量的影响

3 讨论

医用塑料用于制造人工脏器或输血袋、输液袋等医疗器械，由于要与人体、血液或药液接触，要求塑料材料中的组分不能析出进入药液或人体，不会引起组织器官的毒性和损伤。目前，有约1/3的医疗器械由聚氯乙烯(PVC)材料制成。PVC类材料在医疗器械中应用广泛，最主要原因是其具有柔软性和易弯曲性等良好的物理性质。此外，这类材料与静脉注射液和血液之间具有良好的相容性[6]。常见的PVC类产品中都含有增塑剂如邻苯二甲酸酯(DEHP)、TOTM等，用以改进材料的柔软性、延伸性和加工性。这种增塑剂与 PVC的结合是一种物理过程，会随着时间的增长而缓慢逸出，进入到与之接触的介质中; 同时，部分药物或药用辅料的助溶作用促进了增塑剂从材料中的释放，增加了患者暴露于增塑剂中的可能性[7]。现有文献[2]报道，医疗器械塑料制品中DEHP的24～72 h溶出率为1.27%～1.34%，对苯二甲酸二辛酯(DEPT) 为0.11%～0.46%，而TOTM为0.07%～0.17%; 相较于其它种类的增塑剂，TOTM溶出率具有更明显的时间依赖性。我国《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》严格规定了DEHP从食品包装材料迁移到食品的迁移量为1.5 mg/kg，与世界发达国家的规定一致。因此，人们对增塑剂的生物安全性评估颇为关注[8-10]。现已明确DEHP的成人每日摄入限定量为25 mg/kg[2]，但目前有关TOTM的毒性研究及成人每日摄入限定量尚不明确。

本实验通过体外实验，评估了TOTM对多种肝细胞的毒性作用，结果显示TOTM对HepG2、LO2、Hep1-6肝细胞的IC50分别为1.74 mg/mL、0.34 mg/mL和0.23 mg/mL。随着TOTM浓度剂量的增加, 0.125～1.0 mg/mL剂量的TOTM能升高人正常肝细胞上清中AST、ALT含量, 促进LDH释放,并可诱导细胞凋亡。项目组前期研究表明，TOTM可引起小鼠肝组织细胞坏死和脂滴堆积，这一结果亦佐证了本实验结果。证明了TOTM具有潜在的肝毒性，但其具体的毒性机制急需进一步的研究。参考文献:

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[中图分类号]Q95-33

[文献标识码]B

[文章编号]1674-5817(2016)02-0212-04

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.011

[收稿日期]2015-12-28

[基金项目]浙江省食品药品监管系统科技计划项目(2014001),浙江省卫生高层次人才项目(014)

[作者简介]陈献花。E-mail: 919940015@qq.com

[通讯作者]应华忠。E-mail: YHZ0101@126.com