鹿瓜多肽关节腔注射治疗家兔类风湿性关节炎实验研究

冯艳琴, 敖金波, 杨 敏, 程建明, 陈德森(十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院. 骨科, . 康复中心, . 湖北医药学院, 十堰, 44000)



鹿瓜多肽关节腔注射治疗家兔类风湿性关节炎实验研究

冯艳琴1, 敖金波2, 杨 敏1, 程建明2, 陈德森3
(十堰市太和医院 湖北医药学院附属医院1. 骨科, 2. 康复中心, 3. 湖北医药学院, 十堰, 442000)

[摘要]目的 研究鹿瓜多肽治疗家兔类风湿性关节炎(RA)的机制。方法 用小牛软骨II型胶原+弗氏完全佐剂0.1 mL于家兔左膝关节腔内多点注射的方法制备RA模型，模型动物分为模型组及低、高剂量鹿瓜多肽(1 mg/d、2 mg/d)治疗组(A、B组)，分别计算治疗后1 d、7 d、14 d、21 d足肿胀度，测定关节积液中透明质酸(HA)、白细胞介素-1b(IL-1b)，基质金属蛋白酶(MMP-3)及骨形态发生蛋白(BMP)含量。结果 与模型组比较，鹿瓜多肽低、高剂量组14 d、21 d时动物足肿胀度、MMP-3、IL-1b含量明显降低，BMP、HA含量明显升高(P<0.05)，低、高剂量组间无明显差异(P>0.05)。结论 鹿瓜多肽可提高家兔关节腔HA合成及BMP分泌，抑制MMP-3及IL-1b对关节滑膜的浸蚀而达到治疗RA的目的。

[关键词]家兔; 类风湿性关节炎(RA); 鹿瓜多肽

类风湿关节炎 (rheumatoid arthritis，RA) 是以关节病变为主的自身免疫性疾病，由于关节滑膜慢性炎症浸润，临床表现主要为小关节滑膜性关节肿痛，继而关节软骨破坏、关节间隙变窄，晚期由于骨质严重破坏、吸收而导致关节僵直、畸形、功能障碍等，常累及心脏[1]。现代医学证实，RA病理机制可能与基质金属蛋白酶(MMP-3)活性增强、白细胞介素-1b(IL-1b)合成过多有关, MMP-3可降解关节基质，IL-1b作为炎症介质，与RA发生发展密切相关[2]。有证据表明，在罹患RA后骨形态发生蛋白(BMP)作为高效成骨活性因子被大量激活，抑制关节滑膜炎症反应[3]。RA有反复发作、中青年女性好发且致残率较高、预后不良等特点，目前尚无根治方法。为寻找RA的有效治疗药物，本实验在建立家兔RA模型的基础上，采取关节腔内注射鹿瓜多肽来观察其对RA兔足肿胀度及关节积液中HA、IL-1b、BMP及MMP-3含量等的影响，试图分析药物治疗机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组与饲养

2～3 月龄普通级雄性日本大耳白家兔40 只，体质量2.0～2.2 kg, 由湖北医药学院实验动物中心提供[ SCXK(鄂)2011-000], 均用普通饲料喂养(每日50 g/kg), 每笼1只, 自由饮水[SYXK(鄂)2011-0031]。

1.2 药品与试剂

注射用鹿瓜多肽(黑龙江迪龙制药有限公司，批号: H20060625), 小牛软骨Ⅱ型胶原(徐州宗耀堂生物科技有限公司, 批号: QS371006014996)，弗氏完全佐剂[华中海威(北京)基因科技有限公司, 批号: F5881], MMP-3 ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司, 批号: SBJ-T0005)。透明质酸(HA)试剂盒(批号: B-E13398)、IL-1b ELISA试剂盒(批号:QY-R95200)和兔BMP ELISA试剂盒(批号：96T/ 48T)均由上海钰博生物科技有限公司生产。

1.3 类风湿性模型制备与分组

参照文献[4]，剃去家兔左膝关节处被毛，碘伏消毒皮肤，于左膝关节腔内注射小牛软骨Ⅱ型胶原加弗氏完全佐剂0.1 mL造模，2周后将兔分成模型组、鹿瓜多肽低剂量组(A组)及高剂量组(B组)。

1.4 治疗方法

将鹿瓜多肽干冻粉用灭菌注射用水溶解稀释成质量分数1%的溶液备用，兔的用药量可根据人与动物体表面积换算公式[(兔用药剂量(mg/kg)=W(人与兔体表面积换算系数)×A(人用药剂量)]计算[5]，鹿瓜多肽人的用药量是8～16 mg/d, 兔用量以1%鹿瓜多肽药量换算后，每日关节腔内注射鹿瓜多肽一次进行治疗, A组1 mg/d(0.1 mL)、B组为2 mg/d (0.2 mL), 模型组注入(0.1 mL)生理盐水作为对照, 连续治疗21 d。每日强迫动物活动30 min。

1.5 检测指标及方法

于治疗1 d、7 d、14 d、21 d测量左足体积并分别计算足肿胀度，参照文献[6]分别抽取不同治疗时间点膝关节腔积液并编号，-4℃暂存，检测时取关节腔积液，加入底物，以5 000 r/min离心20 min, 取上清液，严格按照说明书操作，试验结果判定必须以酶标仪读数确定HA、IL-1b、BMP及MMP-3值。足肿胀度的测定：测量左足趾关节以下部位的容积，连续3次，取平均值为左足容积，计算各组动物足肿胀度%=(造模后容积-造模前容积)/造模前容积×100%。

1.6 统计分析

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析，不同治疗时间BMP、MMP-3、HA、IL-1b采用球形检验分析，不同组间比较应用方差分析，实验数据以± s表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

造模动物出现左膝关节僵硬、活动受限; 关节红肿、表皮发热、触摸时动物因疼痛躲避、关节软组织肿胀, 可感觉关节腔大量渗出液或关节腔积液。

2.2 足肿胀度比较

A组、B组兔在治疗7 d时开始消肿，但与模型组比较无显著差异(P>0.05)，14 d足肿胀度明显下降(P<0.05)。21 d后基本恢复正常，足肿胀度明显低于模型组(P<0.05)，但A、B组间无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组兔足肿胀度 %

2.2 不同治疗时间相关指标比较

模型组各指标在各时间点各无明显变化。 A、B组兔关节腔积液BMP 、HA在治疗14 d、21 d明显升高(P<0.05)，A、B组MMP-3、IL-1b在治疗14 d、21 d明显降低(P<0.05)，但A组与B组间均无显著差异(P>0.05)(表2)。

3 讨论

鹿瓜多肽由葫芦科植物甜瓜(Cucumis melo L.)的干燥成熟种子及梅花鹿(Cervus nippon Temmick)的骨骼中提取的复方灭菌干冻粉[7]， 属于多肽类生物活性复合物，内含丰富成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-b)及BMP等多种骨诱导多肽类因子。由于其甜瓜籽提取物富含多种游离氨基酸和有机钙、磷等多种成分[8]，可调节骨钙、磷代谢, 刺激成骨细胞增殖、促进新骨形成, 防止骨质疏松, 并具有较强的镇痛抗炎抗风湿等作用[9]。故该药常用于治疗骨质疏松、骨折及RA等疾病。中医认为类风湿性关节炎属“痹证”，由“风、寒、湿”合而成痹，此类患者常挟湿气下注于关节[10]。由于软骨分解及合成代谢失衡及筋络脉隧痹阻不通，多继发滑膜与滑液炎，其病理改变多以膝关节滑膜受损及关节腔积液为主[11]。

表2 鹿瓜多肽不同治疗时间兔关节腔积液中各指标比较

实验数据显示, 治疗14 d及21 d时, A、B组MMP-3阳性表达明显降低，在治疗7 d、14 d、21 d显示，A、B组BMP及HA明显升高， IL-1b含量明显降低，足肿胀度明显低于模型组，提示鹿瓜多肽治疗风湿性关节炎时，能有效降低IL-1b分泌、抑制MMP-3阳性表达，降低模型动物足肿胀度，升高BMP、HA。这可能是鹿瓜多肽通过抑制IL-1b产生，减轻炎症介质IL-1b对关节软骨及滑膜的炎症刺激，降低了对软骨细胞正常结构和功能的破坏、MMP-3对基质的降解，减轻关节软骨周围骨赘的形成, 从而缓解关节疼痛的临床症状，改善关节功能。正常的关节滑液中仅含有微量的IL-1b，但在类风湿性关节液中IL-1b的含量则异常增高[12]。IL-1b作为重要的炎性介质具有细胞破坏能力, 其在退行性骨关节病中发挥重要作用[13]。HA是由 d葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺二糖单位有规律重复构成的大分子链状多糖，化学本质为糖胺多糖，广泛分布于机体的结缔组织、关节软骨、关节腔的滑液中，是关节软骨基质及关节滑液重要成分[14]。关节腔中适量的HA可减少风湿性关节类风湿因子及IL-1b等炎性介质的扩散，降低关节滑膜通透性而减少关节内渗液暨关节积液的形成[15]。本实验数据显示，关节积液中HA含量升高可能是鹿瓜多肽关节炎腔内注射吸收后促使单核吞噬细胞及滑膜内衬B型滑膜细胞分泌HA，从而起到润滑关节、保护关节软骨、延缓软骨退变的作用。而BMP作为一种骨诱导因子，是间充质细胞向骨系细胞转化的信号传导介质，具有诱导间充质细胞转化为成骨细胞和软骨细胞的作用。BMP能够诱导动物或人体间充质细胞分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经组织。同时，BMP还可通过调节TGF-b和FGF而诱导新骨形成，从而促进钙、磷代谢，增加骨钙沉积，防治和改善骨质疏松的发生[16]。鹿瓜多肽干冻粉中富含多种游离氨基酸，为成骨细胞合成BMP骨源性生物因子提供能量和原料，可促进骨源性生物因子的合成。实验证实鹿瓜多肽增加BMP的合成, 抑制了MMP-3过度表达。这可能是鹿瓜多肽关节炎腔内注射吸收后促进BMP的合成, 促进成骨细胞有丝分裂及趋化作用[17]。同时，鹿瓜多肽在关节炎腔内注射吸收后降低关节局部毛细血管通透性，减少IL-1b合成及炎性渗出，降低因炎症刺激而造成MMP-3细胞阳性表达，促进局部炎症及组织粘连时血运障碍的恢复，改善关节局部的血液循环。

综上所述，鹿瓜多肽关节炎腔内注射吸收后，通过增强RA模型兔关节积液中HA及滑膜BMP，降低关节液中IL-1b分泌及其对关节的炎性刺激，减少MMP-3对关节及节软骨滑膜、骨质降解而影响关节及骨代谢，修复已遭类风湿因子及IL-1b等炎性介质破坏的关节滑膜，对RA具有明确的治疗作用。

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Experimental Study on Treatment of Rheumatoid Arthritis in Rabbits by Injection of Deer Melon Polypeptide

FENG Yan-qin1, AO Ji-bo2, YANG Min1, CHEN Jian-ming2, CHEN De-sen3
(Taihe Hospital, Affiliated Hospital of Hubei Medical College, 1. Orthopedics, 2. Rrehabilitation Center, 3. Hubei Medical College, Shiyan, 442000, China)

[Abstract]Objective To study the mechanism of the treatment on rheumatoid arthrist (RA) in rabbits by deer melon polypeptide. Methods Calf cartilage II collagen+Freund’s complete adjuvant (0.1 mL) was injected intra-articular in right knee of rabbits to prepare RA model. The model rabbits were randomly divided into model group, low and high dosage deer melon polypeptide group (Group A and B) with 1 mg/d or 2 mg/d. The paw swelling were calculated at 1, 7, 14, 21 days after treatment, the hyaluronic acid (HA), interleukin-1b (IL-1b), matrix metalloproteinase (MMP-3) and bone morphogenetic protein (BMP) content in joint effusion were measured. Results Compared with the model group, paw swelling were occurred in the rabbits of group A and B, MMP-3 and IL-1b were significantly decreased, BMP and HA significantly increased(P<0.05), but no difference between groups A and B (P<0.05). Conclusion The deer melon polypeptide had the treatment effects on RA in rabbit by improving the RA synthesis and BMP secretion in articular, and inhibiting the erosion of MMP-3 and IL-1b on synovial.

[Key words]Rabbit; Rheumatoid arthritis (RA); Deer melon polypeptide

[中图分类号]Q95-33

[文献标识码]A

[文章编号]1674-5817(2016)03-0204-04

doi:10.3969/j.issn.1674-5817.2016.03.009

[收稿日期]2015-10-09

[基金项目]湖北省教育厅重点项目(B20122406)

[作者简介]冯艳琴(1977-), 女, 主管护师。E-mail: cdscds1226@126.com

[通讯作者]陈德森(1970-), 男, 副教授, 主要从事专业: 病理与生理学。E-mail: chends1226@163.com