羊接触传染性脓疱皮炎病毒PCR检测方法建立及初步应用

常 亮，党 岩，郭海龙

(甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000)

羊接触传染性脓疱皮炎病毒PCR检测方法建立及初步应用

常 亮，党 岩，郭海龙

(甘肃省畜牧兽医研究所，甘肃平凉744000)

以GenBank上羊接触传染性脓疱皮炎病毒(ORFV)B2L基因序列,用Primer premier 5.0软件设计1对引物并合成,经PCR条件优化，确定了最佳的PCR反应条件,建立了羊接触传染性脓疱皮炎病毒PCR检测方法。结果显示,设计的引物能扩增出的PCR产物为540bp左右，与预期大小一致；同时检测山羊痘病毒，结果均为阴性；该方法能检出羊接触传染性脓疱皮炎病毒最低量为5pg。经证实，建立起羊接触传染性脓疱皮炎病毒PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可用于临床病料检测。

羊接触传染性脓疱皮炎病毒；PCR；特异性；灵敏度

羊接触传染性脓疱皮炎，又称羊传染性脓疱皮炎、羊传染性脓疮、羊口疮，是由羊传染性脓疱病毒又称羊口疮病毒感染引起绵羊、山羊的接触性、嗜上皮性传染病[1]，以口唇等处的皮肤和粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂为特征，羊群的发病率高达90%,病死率1%-25%[2],给养羊业造成了巨大的经济损失。人、犊牛、骆驼等也可感染本病。目前本病诊断有电子显微镜检查、病毒分离、接种试验和AGP等方法[3-7]。由于本病与羊感染口蹄疫病毒、羊痘病毒临床症状相似,特别在继发感染或混合感染难以区分，这就为本病的确诊增加了难度。为了准确、快速检测本病，本研究建立了羊传染性脓疱皮炎病毒PCR方法，经初步应用取得良好的检测效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株及临床样品

羊接触传染性脓疱皮炎病毒、山羊痘病毒毒株,由本实验室保存；临床血样采集甘肃省平凉市、庆阳市和张掖市肃南裕固族自治县等地羊只,低温保存。

1.1.2 试剂盒及试剂

Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTP、DNA Marker、琼脂糖等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank中ORFV的全基因序列中较保守的B2L基因序列，设计引物1对，预计扩增目的片段大小为 540bp。上游引物为 P1:5’-CACGGCCACGAACTTCCACCTCAA-3’, 下游引物 P2:5’-TCCCGCTCGAAGACCGCAGACAG-3’,预计产物大小为540bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成提供。

1.2.2 病毒DNA的提取

羊接触传染性脓疱皮炎病毒细胞毒DNA提取：取500μL细胞毒液于离心管中，煮沸10min，冰水水浴3min，10000r/min离心10min,取上清做模板。

临床样品血样DNA提取：取血样200μL至2.0mL离心管中，依次加入00μL灭菌双蒸水、400μL6mol/L的碘化钠、800μL氯仿-异戊醇（24:1），颠倒混匀，14000r/min 离心 10min；吸上层水相500μL于另一离心管中，加入300μL异丙醇，80μL3mol/L醋酸钠，混匀后 -20℃静置10min，14000r/min离心 10min；弃上清，加 70%乙醇 1mL，混匀，14000r/min离心 5min，弃去乙醇，晾干，加20μL灭菌双蒸水4℃保存。

1.2.3 PCR扩增

25μL 反应体系：10×PCR Buffer(含 Mg2+)2.5μL、dNTP 混 合 物 (各 2.5mmol/L)3μL、Taq DNA 聚合酶 (2.5U/μL)0.2μL、上引物 P1、P2(10pmol/μL)各 1.0μL、DNA 模板 2.5μL、灭菌双蒸水(ddH2O)加至 25μL。

经优化后PCR条件:94℃预变性5min,94℃变性 30s,56℃退火 30s，72℃延伸 30s，32个循环,最后72℃延伸10min。

取扩增产物8μL与溴酚蓝缓冲液2μL混匀,加样于2%琼脂糖凝胶中，电泳后,观察结果。

1.2.4 PCR扩增的特异性试验

用建立的PCR方法分别检测羊接触传染性脓疱皮炎病毒、山羊痘病毒和健康羊血样。

1.2.5 PCR扩增的敏感性试验

以羊接触传染性脓疱皮炎DNA为样本,经722型紫外可见分光度计测定OD260nm值,计算出样本DNA的含量。按10倍比稀释样本,分别以不同含量的羊接触传染性脓疱皮炎病毒的DNA为模板进行PCR扩增,以检测所建立方法的敏感性。

1.2.6 临床样品的检测

用建立的PCR方法对收集的10份发病羊的血样进行检测。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增

从图1看出,用ORFV提取的病毒DNA，经PCR扩增出约540bp的特异性条带,与预期扩增的目的片段大小相吻合；健康羊血样DNA未扩增出条带。结果与预期一致,说明建立的该方法可用于羊接触传染性脓疱皮炎病毒的扩增。

图1 ORFVB2L基因序列PCR扩增

注：M.DNA 标准 DL600；1.空白对照；2.阴性对照（山羊痘病毒）；3.阳性对照（ORFV病毒煮沸稀释 103倍）；4-5.ORFV 病毒 DNA；6-7.健康羊血样提取DNA后扩增产物

2.2 PCR的特异性

从图2可知,采用PCR方法扩增山羊痘病毒和健康羊血样DNA提取物,除羊接触传染性脓疱皮炎病毒扩增出约540bp的条带外,山羊痘病毒、健康羊血样均为阴性。结果显示,该方法具有良好的特异性,如病料中含山羊痘病毒不受影响。

图2 ORFV病毒B2L基因序列PCR特异性检测

注：M.DNA标准 DL600；1-4.山羊痘病毒PCR扩增产物；5.阳性对照（ORFV病毒煮沸稀释103倍）；6-9.ORFV病毒 DNA扩增产物；10-13.健康羊血样提取DNA后扩增产物

2.3 PCR扩增的敏感性

按DNA的含量,依次进行10倍比稀释,PCR扩增结果为5pg模板仍可见清晰目的条带,说明有较好的敏感性,病毒含量极少的情况且下也可被检出(图 3)。

图3 ORFV病毒B2L基因序列PCR敏感性检测

注：M.DNA 标准 DL600；1.空白对照；2.阴性对照（山羊痘病毒）；3.阳性对照（ORFV病毒煮沸稀释 103倍）；4-9. 为 ORFV 病毒 DNA50ng、5ng、0.5ng、50pg、5pg、0.5pg

2.4 临床样品的检测

对收集的2个规模养羊场的10头临床发病山羊的血样进行检测,9份PCR扩增为ORFV阳性,1份扩增为阴性,阳性检出率为90%(9/10)(图4),说明该方法在临床上阳性检出率高,适合于临床诊断。

图4 ORFV病毒临床样品检测

注：M.DNA 标准 DL600；1.空白对照；2.阴性对照（山羊痘病毒）；3.阳性对照（ORFV病毒煮沸稀释103倍）；4-13 10只发病羊血样提取DNA扩增后PCR产物条带

3 小结与讨论

目前,羊接触传染性脓疱皮炎病在所有养羊的国家和地区均有发生,以澳大利亚、新西兰等国最为严重。我国甘肃、新疆、内蒙古、陕西、西藏、四川和云南等省区广泛流行,给养羊业带来巨大经济损失。羊接触传染性脓疱皮炎临床上分为唇型、蹄型和外阴型,以唇型感染为主,其特征为口唇等处皮肤和粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡和结成疣状厚痂。羊痘、羊口蹄疫的临床症状与羊接触传染性脓疱皮炎极为相似,临床上容易误诊。实验室检测羊接触传染性脓疱皮炎的方法较多，如电镜观察、病毒分离、接种试验、血清学、琼脂免疫扩散法等[3-7]。目前,常用琼脂免疫扩散法诊断ORFV,但因ORFV是局部免疫发挥主要作用,感染羊血清中约需要3－6周的时间才可出现较高效价的抗体,故结果判定中常出现假阴性结果；副痘病毒具有典型的外观特征,可用电子显微镜简单直观检查,但电子显微镜价位较高,操作复杂等缺点,临床应用上受到限制；病毒分离培养主要用羊、犊牛睾丸细胞进行培养,需要较高的要求和较长的时间,且在培养过程中也有可能出现因组织毒性作用使细胞受损而误判为病毒分离性,因此也不宜进行推广。

本研究采用PCR方法对羊接触传染性脓疱皮炎病毒、山羊痘病毒、健康羊血样DNA提取物同时进行扩增,除羊接触传染性脓疱皮炎病毒能扩增出约540bp的条带外,山羊痘病毒、健康羊血样均为阴性,结果表明,该方法对检测羊接触传染性脓疱皮炎病毒具有快速、准确、特异和灵敏的特点,是ORFV及时确诊的可靠手段。

针对目前国内存在ORFV检测方法不完善和检测时间较长等缺点,本研究针对ORFV的B2L基因是主要保守基因特点，设计ORFV特异性引物,扩增目的片段大小为540bp。本研究建立的PCR方法易于扩增,试验条件要求不高,适合于一般的实验室,易于推广。该方法对羊接触传染性脓疱皮炎病毒的检测敏感性高,最小检出量为5pg,且对模板的要求很低,只需对组织样品进行简单处理便可使用,可对疑似病例做出快速诊断。本研究应用建立的PCR方法对10份临床样品，阳性检出率为90%。因此,本研究所建立的PCR方法快速、准确、灵敏度高、特异性好，可为ORFV确诊提供保证。

[1]殷震,刘景华.动物病毒学[M].北京:科学出版社,1997.

[2]陈燕军.羊口疮的研究血清学方法的研究[J].兽医科技杂志,1982(7):14-19.

[3]白积荣,沈正达,王锡贞,等.羊口疮病毒形态发生的电镜观察[J].中国兽医科技,1985(11):34-36.

[4]王良娟,马维卿,张再清.应用对流免疫电泳检测细胞培养物中羊口疮病毒抗原[J].甘肃畜牧兽医,1992(3):7-8.

[5]何水林,陈杰,蔡玉书,等.羊口疮病毒的分离与鉴定[J].中国兽医科技,2002,3(9):21-23.

[6]庞理化,程庆华,侯秀芬,等.羊口疮病毒组织培养初报[J].青海畜牧兽医杂志,1982(3):66-69.

[7]张素珍,张惠安,邝明慧,等.羊口疮病原的分离与鉴定的研究[J].中国兽医科技,1987(4):3-4.

S858.26

A

1003-8655（2016）05-0024-03

甘肃省农业生物技术研究与应用开发项目（项目编号：GNSW-2013-25）。

常亮（1982-），甘肃静宁人，本科，助理研究员，主要从事动物病毒性传染病防治技术的研究工作。