固定化漆酶在循环冷却水系统除油中的应用

刘　芳， 张　双， 吕玉翠， 樊丰涛， 陆津津， 赵朝成， 王永强， 孙　娟

(中国石油大学 化学工程学院，山东 青岛 266555)

固定化漆酶在循环冷却水系统除油中的应用

刘芳， 张双， 吕玉翠， 樊丰涛， 陆津津， 赵朝成， 王永强， 孙娟

(中国石油大学 化学工程学院，山东 青岛 266555)

摘要：采用包埋法、交联法和包埋-交联法固定化漆酶，对比了3种固定化漆酶与游离酶的酶学性质。将最佳固定化漆酶投加于柴油泄漏循环水中，考察其对泄漏油品的去除效果。结果表明，交联法固定化漆酶活性最好，为0.66 U/g，包埋-交联法固定化酶最差，为0.38 U/g；固定化提高了漆酶酸碱稳定性和热稳定性。在100 mL柴油质量浓度为120 mg/L、pH值为6的循环水中，加入9 g固定化酶量，反应6 h，包埋法固定化漆酶除油率仅为24%，而交联法固定化漆酶除油率高达77%。

关键词：漆酶； 固定化； 活性； 循环水； 石油； 降解

物料泄漏入循环冷却水系统，会影响循环冷却水水质，加剧设备腐蚀和微生物孳生[1-2],增加企业的生产及维护成本[3]，是石油炼化企业面临的共性问题。因此，研制新型材料，消除物料泄漏造成的不利影响，是石油炼化企业积极推进清洁发展、节约发展的迫切需要。

漆酶(Laccase, EC1.10.3.2)是一种含铜多酚氧化还原酶，可以催化各种酚型和非酚型的化合物发生氧化反应，同时将氧还原成水。最早由日本学者Yoshida在树漆中发现了漆酶的成分，随后法国人Bertrand正式确定为漆酶[4]。漆酶大多来自真菌、高等植物和细菌[5]，作为生物催化剂，具有高效、专一、温和、环保等特点[6]，已经得到国内外的广泛关注。漆酶的作用底物非常广泛，能够催化氧化多种难降解的有机污染物，在食品工业、染料脱色、废水处理、生物传感器等方面具有重要的应用价值[7]。然而，游离的漆酶蛋白在作用过程中易受环境条件影响而变性失活，限制了其工业化应用，提高漆酶的稳定性是研究漆酶必不可少的过程。罗开昆等[8]提出了漆酶的固定化技术，将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机载体上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。这样，在极端的环境中，既能保持酶的催化活性，又能克服游离酶的缺点，具有稳定、易分离、可重复利用等优点。

漆酶在不同载体上成功固定的研究很多。例如，Lloret等[9]将酶共价固定在Eupergit(一种共聚物)上，获得的酶活性较好，但是酶底物亲和力较差。张书祥等[10]将漆酶固定在尼龙网载体上，用戊二醛交联，但酶活回收率需要提高。此外，也有纳米材料固定化漆酶[11]用于生物传感器，活性炭吸附与海藻酸钠凝胶结合固定漆酶对二氯酚脱氯[12]等的研究。

王伟宸[13]、尚伟龙[14]和陈新芳[15]分别采用酶法(包括辣根过氧化物酶和漆酶)处理含油废水的相关研究，并且取得了较好的除油效果。笔者分别采用海藻酸钠包埋法、壳聚糖交联法和包埋-交联法固定化漆酶，比较了这3种方法获得的固定化漆酶的酶学性质，选出最优的固定化方法，并将固定化漆酶用于去除循环冷却水系统泄漏的油品，研究固定化漆酶的应用效果。

1实验部分

1.1样品

漆酶(10000 U)，生化试剂，夏盛实业集团有限公司产品。海藻酸钠、愈创木酚，化学纯；壳聚糖，生化试剂；戊二醛(25%质量分数)、琥珀酸、无水氯化钙、无水硫酸钠，分析纯，均为国药集团化学试剂有限公司产品。石油醚(60～90℃)、乙酸、氢氧化钠、95%(体积分数)乙醇、浓硫酸、氯化钠，分析纯，均为西陇化工股份有限公司产品。

直馏柴油，购于江苏新海石化有限公司。实验用循环水，取自青岛某炼化企业的循环冷却水系统。

1.2漆酶活性的测定方法

1.2.1游离酶的活性测定

取8 mL摩尔浓度为50 mmol/L的琥珀酸钠(pH值为4.5)缓冲液，加入0.04 mmol愈创木酚(1 mL 95%乙醇中溶有4.5 μL愈创木酚)和1 mL稀释的漆酶溶液(pH=4.5的琥珀酸钠缓冲液稀释的酶溶液)，组成10 mL反应体系，25℃恒温水浴中反应30 min后，采用上海元析仪器有限公司UV6000-PC紫外可见分光光度计，于465 nm波长处测定吸光度。

定义1 min内催化氧化1 μmol愈创木酚的酶量为酶活单位(U/mL)，游离酶的酶活B1可由式(1)计算。

(1)

式(1)中，V为反应体系总体积，mL；V1为加入酶液体积，mL；A为吸光度；t为反应时间，min；ε为愈创木酚吸光系数，ε465=1.21×104L/(mol·cm)；L为比色光径，cm，本实验中L=1 cm。

1.2.2固定化酶的活性测定

采用上述反应体系，加入1 g固定化酶，在25℃恒温水浴中反应30 min，取出后测定465 nm处吸光度。以每g载体的酶活力(U/g) 表示固定化酶酶活B2，由式(2)计算。

(2)

式(2)中，m为加入固定化酶的质量，g。

1.3固定化漆酶的制备

1.3.1包埋法

称取4 g的海藻酸钠溶于200 mL蒸馏水中，搅拌使海藻酸钠完全溶解成为均匀的胶体。在海藻酸钠胶体中加入总酶活为50 U的酶液(pH=4.5的琥珀酸钠缓冲液稀释的酶溶液)，搅拌使混合均匀。使用规格为10 mL的一次性注射器将混合好的海藻酸钠酶液逐滴滴到2%质量分数的氯化钙溶液中，形成球状。静置20 min后，放于25℃的恒温水浴摇床上振荡固定4 h，取出过滤，用蒸馏水进行3～5次抽滤，室温下干燥，得到的球状物就是包埋法固定化酶，按照固定化漆酶的测定方法测定其酶活性。

1.3.2交联法

称取6 g的壳聚糖粉末溶于200 mL 1%质量分数的乙酸中，玻璃棒搅拌，使其成为均匀胶体。用注射器将壳聚糖胶体逐滴加到2 mol/L的NaOH溶液中，使胶体形成球状颗粒，在滴球的过程中注意不要让球滴间接触，避免球滴之间相互黏在一起。静置使其全部成为球状颗粒后，用蒸馏水洗去NaOH溶液，抽滤至中性，在室温下干燥，得到球状壳聚糖载体。

取2 g壳聚糖载体放入1.5%质量分数戊二醛溶液中，在25℃的水浴摇床上振荡10 min，静置交联20 h。交联完毕后用蒸馏水抽滤洗去多余的戊二醛，室温干燥，得到交联后壳聚糖载体。

将壳聚糖载体按照每g需1 mL漆酶液的比例放入总酶活为50 U的漆酶液(pH=4.5的琥珀酸钠缓冲液稀释的酶溶液)中，25℃恒温水浴摇床中以150 r/min速率固定8 h。蒸馏水洗去载体表面的酶液，抽滤，室温下干燥，得到交联法固定化酶，按照固定化漆酶的测定方法测其酶活性。

1.3.3包埋-交联法

在2%质量分数的海藻酸钠凝胶内加入总酶活为50 U的漆酶溶液(pH=4.5的琥珀酸钠缓冲液稀释的酶溶液)，包埋。海藻酸钠凝胶无气泡后用10 mL 注射器滴入0.5%质量分数的CaCl2溶液中形成球状载体，固定6 h后，洗净抽滤。然后将球状载体放到1.5%质量分数的戊二醛中，恒温水浴振荡10 min，交联静置20 h。交联完毕后用蒸馏水洗去多余的戊二醛，抽滤，室温干燥，得包埋-交联法固定化酶，按照固定化漆酶的测定方法测其酶活性。

1.4固定化漆酶的酶学性质的测定

1.4.1最适pH值及酸碱稳定性的测定

在pH值介于2.5～7.0之间的8 mL琥珀酸钠系列缓冲溶液中分别加入1 mL 总酶活为50 U的酶液(pH=4.5的琥珀酸钠缓冲液稀释的酶溶液)或 1 g 固定化酶，室温下放置30 min后，再按照漆酶活性测定方法分别测定各组酶活性。

1.4.2最适温度及热稳定性的测定

在含有8 mL琥珀酸钠缓冲溶液(pH=4.5)的小烧杯中加入1 mL总酶活为50 U的酶液(pH=4.5的琥珀酸钠缓冲液稀释的酶溶液)或1 g固定化酶，分别放入温度为15、25、35、45、55、65℃的恒温水浴中30 min，取出，按照漆酶活性测定方法分别测定酶活性。

1.5固定化酶处理含油循环冷却水实验

前期研究表明，当循环水中含油质量浓度为120 mg/L时，挂片腐蚀率最大，故在含油质量浓度120 mg/L的100 mL循环水样中加入1.5～9 g固定化酶，调节水样pH值(3～8)，置于25℃恒温水浴摇床反应1.5～9 h。结束后先将水样中的固定化酶全部捞出，中止反应。测剩余油质量浓度。

循环水样中的泄漏油为柴油，在20℃时密度0.839 g/cm3，属轻质柴油；35℃下黏度较小，为3.26 mm2/s；柴油中的Zn和Fe的质量分数分别为2.38 μg/g和0.91 μg/g 。采用紫外分光光度法测定水样中柴油含量[16]，测定波长225 nm，石油醚为参比溶液，用10 mm石英比色皿测定吸光度，根据实验得出的标准曲线Y=0.0374X+0.0221(R2=0.9991)及式(3)计算柴油质量浓度c。然后由式(4)计算除油率X。

(3)

(4)

式(3)中，c0为待测溶液柴油质量浓度，mg/L；V1为水样体积，mL；V2为待测溶液体积，mL；n为溶液稀释倍数。

循环水样取自青岛某炼化企业，按《水和废水监测分析方法》[17]分析水质指标，分析结果如表1所示。根据循环水水质特点，确定处理含油循环水的控制条件。

表1　实验使用的循环水水质

1) Based on CaCO3

2结果与讨论

2.1漆酶的3种固定化方法对比

图1为包埋法、交联法以及包埋-交联法3种方法得到的固定化漆酶的活性对比。由图1看到，包埋法、交联法和包埋-交联法所得固定化漆酶活性分别为0.52 、0.66 和0.38 U/g，交联法固定化漆酶活性最好，包埋法次之，包埋-交联法最差。图2为3种酶的固定化形成过程，所得固定化漆酶外观如图3所示。

由图3可见，包埋法所得的固定化漆酶颗粒大小均匀，弹性较大，机械强度好，边缘光滑；交联法所得的固定化漆酶活性高，弹性大，边缘十分光滑，固定化漆酶较壳聚糖载体变色效果明显，颜色越深所固定酶越多，但施加较大压力会破碎，机械强度差；包埋-交联法所得固定化漆酶活性低，弹性小，但稳定性好，这个结果与徐国英等[18]的研究相同。由此可以得出，3种方法都有各自的优缺点。油的降解与酶活的高低有直接的关系[19]。包埋-交联法与包埋法原理基本相同，由于采用的交联剂戊二醛在载体表面形成了致密的保护膜而使载体强度增大，从而使固定化漆酶稳定性增强，酶不易流失，造成酶活性不高。因此，只采用了包埋和交联两种固定化漆酶用于含油循环水的除油研究。

图1　3种不同方法制备的固定化漆酶活性对比

图2　3种不同方法制备固定化酶的形成机理

图3　3种不同方法制备的固定化漆酶的外观

2.2固定化漆酶的酶学性质

2.2.1最适pH值及酸碱稳定性

pH值的变化可以改变漆酶分子和底物的带电状态，从而影响漆酶活性部位及底物的解离状态，对催化反应造成影响[20]。图4为游离漆酶和包埋法、交联法固定化漆酶的相对酶活随pH值的变化。图4表明，游离漆酶的最适pH值为3.5，交联法固定化漆酶最适pH值为3，包埋法固定化漆酶最适pH值为4.5。交联法固定化漆酶的pH值向酸性偏移，对酸的适应性增强；包埋法固定化漆酶的pH值向碱性偏移，对碱的适应能力增强。最适pH值的变化是由载体的静电荷决定的，壳聚糖为阳离子型载体，其表面具有游离氨基，使得固定化酶周围的微环境内呈弱碱性,因而要求溶液必须较自由漆酶最适pH 值低，才能达到交联法固定化漆酶的最适pH值[21]。

图4　游离漆酶和包埋法、交联法固定化漆酶的

由图4还看到，pH值在4.5～8时，固定化漆酶和游离漆酶的相对活性随pH值的增加而降低，固定化漆酶的相对活性变化比游离漆酶缓慢，交联法固定化漆酶的活性降低速率小于包埋法固定化漆酶的降低速率；两种固定化漆酶的相对活性都比游离漆酶高，游离漆酶在pH=8时，相对活性几乎为零，而两种固定化漆酶的活性都在40%左右。由此可知固定化漆酶对酸碱的适应性比游离漆酶增强了。

2.2.2最适温度及热稳定性

图5为游离漆酶和包埋法、交联法固定化漆酶的相对酶活随温度的变化。由图5看到，随着温度的升高，固定化漆酶和游离漆酶相对活性均先增大后减小，两种固定化漆酶相对活性在45℃时达到最大值，而游离漆酶相对活性在35℃达最大值。与游离漆酶相比，固定化漆酶的最佳反应温度提高了10℃，说明固定化漆酶的耐热能力较游离漆酶强。实验所得最适温度与张书祥等[22]的固定化漆酶55℃、游离漆酶50℃的结果不同，可能是漆酶来源不同产生的差别。温度为35～65℃时，游离漆酶的相对活性降低速率大于固定化漆酶，固定化漆酶的相对活性高于游离漆酶；65℃时，游离漆酶相对活性接近零，而两种固定化漆酶的相对活性还剩60%左右。由此可得，固定化漆酶较游离漆酶具有一定的热稳定性。酶固定化后，分子之间、酶与载体之间的相互作用使得漆酶分子结构钢性增强[23]，因而热稳定性得到了明显提高。

图5　游离漆酶和包埋法、交联法固定化漆酶的

2.3影响固定化漆酶处理含油循环冷却水除油率的因素

2.3.1固定化漆酶给酶量的影响

固定化漆酶量的多少会直接影响除油效果。给酶量太少时，固定化酶与含油水样接触不充分，除油效果差；给酶量太多，催化氧化反应会有抑制作用，破坏酶的活性中心，使酶失去催化功能。对含油质量浓度120 mg/L的100 mL水样，结合固定化酶的性质与循环水水质特点调节其pH值为6，25℃下恒温水浴摇床反应6 h，考察交联法与包埋法固定化漆酶量与除油率的关系，结果示于图6。图6表明，交联法固定化漆酶的除油效果随给酶量的增加而增大，9 g的给酶量时，除油率可以达到77%左右，除油效果较好；而包埋法固定化漆酶的除油效果不明显，也没有规律，除油率最高只能达到24%左右。包埋法固定化漆酶的除油效果差，可能是水样中的油附在了载体表面，堵塞了载体上的空隙，使得酶大部分不能释放出来，能发挥作用的酶量有限，与给酶量关系不大。从交联法固定化漆酶和包埋法固定化漆酶处理含油循环水的成本看，前者为0.016 RMB/mg油，后者为0.018 RMB/mg油(4.905 RMB/g壳聚糖，1.764 RMB/g海藻酸钠；实验中漆酶为液体溶液，价格便宜，少量使用可忽略成本)，所以除油因素考察以交联法固定化漆酶为主。

图6　除油率(X)与交联法和包埋法固定化漆酶量的关系

2.3.2反应时间的影响

反应时间长可以使固定化漆酶与水样中的油充分接触，除油效果更佳，缺点是长时间的反应可能会使酶失活变性。考虑到经济性，选用给酶量分别为1.5 g和3 g，调节水样pH值为6，25℃下恒温水浴摇床反应，对100 mL含油质量浓度120 mg/L的水样除油，考察反应时间与除油率的关系，结果示于图7。由图7看到，除油率随着反应时间的增加而增大，反应时间从1.5 h增到7.5 h时，给酶量为1.5的除油率从8%升到60%；给酶量为3 g的除油率从10%增加到77%；反应时间从7.5 h增到9 h时，除油率增加变得缓慢，这是漆酶的活力降低、底物浓度下降以及生成物对酶活性的抑制作用的结果[23]。

图7　不同固定化漆酶给酶量下除油率(X)与

2.3.3水样pH值的影响

漆酶在最佳pH值条件下可以最大程度地降解水中的油，而循环冷却水的pH值变化很大， 一般在6～9，所以需确定合适的pH值。在交联法固定化漆酶3 g、25℃下恒温水浴摇床反应6 h的条件下，对100 mL含油质量浓度120 mg/L的水样进行除油，考察水样pH值对除油率的影响，结果示于图8。图8表明，不同pH值时除油率变化没有明显规律，但在pH值为6时最好，除油率为55%左右；pH值大于6时，除油率相对较低。虽然实验结果与陈新芳[15]的研究结果相同，但是与本实验所得交联法固定化漆酶的最适pH值有很大的差距，可能是底物的浓度、化学结构等的差别引起[24]，也可能是反应条件改变了漆酶的pH值所致。

2.3.4壳聚糖载体的影响

调节水样pH值为6，在 25℃下恒温水浴摇床反应6 h，采用壳聚糖载体对含油质量浓度120 mg/L的100 mL水样除油，考察壳聚糖载体量与除油率的关系，结果示于图9。图9表明，壳聚糖没有除油效果，少量的除油率可能是油附着在载体而得。由此得出，交联法固定化漆酶除油效果好完全是漆酶直接与油发生了催化氧化反应的结果。

漆酶的催化氧化反应机理主要表现在底物自由基的生成和漆酶分子中4个铜离子的协同作用[19,25]，其过程如图10所示。底物先结合于酶活性中心的Ⅰ型Cu2+位点，然后通过Cys-His途径传递给三核位点，该位点进一步把电子传递给活性中心的第2底物氧分子，使之还原成水，实现漆酶作用过程。

图9　除油率(X)与壳聚糖载体质量的关系

2.3.5固定化酶操作次数的影响

在调节水样pH值为6、固定化酶量3 g、25℃下恒温水浴摇床反应6 h的条件下，对100 mL 含油质量浓度120 mg/L的水样除油，取出固定化酶重复操作10次，考察相对除油率与固定化漆酶重复操作次数的关系，结果示于图11。图11 表明，操作7次时，相对除油率仍能达到50%，随着操作次数的增加，固定化酶与底物反应，活性部分损失，使得除油率降低；10次操作后，相对除油率降到20%左右。由此可得漆酶固定化可以增加使用率，且重复使用小于等于7次可以达到较好除油效果。

图10　漆酶催化氧化反应示意图

图11　相对除油率与固定化漆酶重复操作次数的关系

3结论

(1)采用包埋法、交联法和包埋-交联法3种方法固定化漆酶，包埋法固定化漆酶活性为0.52 U/g，交联法固定化漆酶活性较高，为0.66 U/g，包埋-交联法所得固定化酶活性低，为0.38 U/g。包埋法和交联法固定化漆酶的酸碱稳定性和热稳定性都较游离漆酶的高。

(2)交联法固定化漆酶的除油效果较好，在100 mL pH值为6的循环水样中，加入9 g固定化漆酶，反应6 h，能达到77%的除油率，而且壳聚糖载体对除油贡献很小，处理成本为0.016 RMB/mg油；包埋法固定化漆酶最高只能达到24%的除油率，成本0.018 RMB /mg油。交联法固定化酶重复操作7次后，相对除油率仍达到50%。

参考文献

[1] LIU F, ZHANG L, YAN X, et al. Effect of diesel on corrosion inhibitors and application of bio-enzyme corrosion inhibitors in the laboratory cooling water system[J].Corrosion Science, 2015, 93:293-300.

[2] ZHONG H Y, LIU F, LU J J, et al. Effect of diesel leakage in circulating cooling water system on preponderant bacteria diversity and bactericidal effect of biocides[J].Environmental Technology, 2015, 36(9):1147-1159.

[3] 伊帆， 李德豪， 郎春燕， 等. 炼油厂循环冷却水的腐蚀机理及缓蚀技术综述[J].广东石油化工学院学报， 2011, 21(6):12-15.(YI Fan, LI Dehao, LANG Chunyan, et al. Review of erosive mechanism and inhibitory technology of circulating wastewater from oil refinery[J].Journal of Guangdong University of Petrochemical Technology, 2011, 21(6):12-15.)

[4] CHRISTIAN M, CLAUDE J, PIERRE B, et al. Fungal laccases: From structure-activity studies to environmental applications[J].Environ Chem Lett, 2003, 1(2):145-148.

[5] JOLANTA B, PAULINA K, ADRIANA R, et al. Laccase immobilization on copolymer of butyl acrylate and ethylene glycol dimethacrylate[J].Biochemical Engineering Journal, 2007, 35(3):325-332.

[6] 杨波， 杜丹， 孙也. 固定化漆酶的研究进展[C]//上海：环境污染与公共卫生会议论文集, 2012:617-620.

[7] COUTO S R, HERRERA J L T. Industrial and biotechnological applications of laccases: A review[J].Biotechnology, 2006, 24(5):500-513.

[8] 罗开昆， 彭红， 龚跃法. 漆酶的固定化及其在废水处理中的应用[J].工业水处理, 2005, 25(5):14-17.(LUO Kaikun, PENG Hong, GONG Yuefa. Immobilization of laccase and its application to waste treatment[J].Industrial Water Treatment, 2005, 25(5):14-17.)

[9] LLORET L， HOLLMANN F， EIBES G， et al. Immobilization of laccase on Eupergit supports and its application for the removal of endocrine disrupting chemicals in a packed-bed reactor[J].Biodegradation, 2012, 23(3):373-386.

[10] 张书祥， 肖亚中， 王怡平， 等. 白腐真菌漆酶的固定化及其应用研究[J].微生物学通报, 2004, 31(5):85-88.(ZHANG Shuxiang, XIAO Yazhong, WANG Yiping, et al.Immobilization of fungal laccase on nylon net and application of the immobilized enzyme[J].Microbiology China, 2004, 31(5):85-88.)

[11] HOU Jingwei, DONG Guangxi, YE Yun, et al. Laccase immobilization on titania nanoparticles and titania-functionalized membranes[J].Journal of Membrane Science, 2014, 452:229-240.

[12] 张树江， 高恩丽， 夏黎明. 固定化漆酶对二氯酚的脱氯作用[J].化工学报, 2006, 57(2):359-362.(ZHANG Shujiang, GAO Enli, XIA Liming. Dechlorination of dichlorophenol in waste water by immobilized laccase[J].Journal of Chemical Industry and Engineering, 2006, 57(2):359-362.)

[13] 王伟宸. 辣根过氧化物酶在改性陶瓷载体上固定化及其在含油废水治理中的研究[D].北京：北京化工大学, 2010:43-61.

[14] 尚伟龙. 漆酶在陶瓷-壳聚糖复合载体上固定化及在含油废水治理中的应用研究[D].北京：北京化工大学, 2009:45-57.

[15] 陈新芳. 油对水质稳定剂性能的影响及酶法处理含油污水的研究[D].北京：北京化工大学, 2007:30-64.

[16] 展慧英.紫外分光光度法测定废水中油的含量[J].甘肃联合大学学报， 2007, 21(1):65-67.(ZHAN Huiying. UV spectrophotometric determination of oil content in waste water[J].Journal of Gansu Lianhe University, 2007, 21(1):65-67.)

[17] 国家环境保护局.水和废水监测分析方法[M].第四版. 北京：中国环境科学出版社， 2002:88-490.

[18] 徐国英， 朱启忠， 董学卫. 海藻酸钠-壳聚糖固定化漆酶的研究[J].西南师范大学学报, 2008, 33(3):90-94.(XU Guoying, ZHU Qizhong, DONG Xuewei. The research of sodium alginate and chitosan immobilized laccase[J].Journal of Southwest China Normal University, 2008, 33(3):90-94.)

[19] 靳蓉， 张飞龙. 漆酶的结构与催化反应机理[J].中国生漆, 2012, 31(4):6-16.(JIN Rong, ZHANG Feilong. The structure and catalytic reaction mechanism of laccase[J].Journal of Chinese Lacquer, 2012, 31(4):6-16.)

[20] IREN M, ANTONELLA G, SLIVIA. Crystal structure of the blue multicopper oxidase from the white-rot fungus Trametes trogii complexde withp-toluate[J].Inorganica Chimica Acta, 2008, 361(14):4129-4137.

[21] 左莹. 壳聚糖对漆酶的固定化研究[D].杨凌：西北农林科技大学， 2008:42.

[22] 张书祥, 房伟. 包埋法固定化真菌漆酶及其应用研究[J].生物学杂, 2005, 12(6):44-46.(ZHANG Shuxiang, FANG Wei. Immobilization of fungal laccase with the embedding method and application of the immobilized enzyme[J].Journal of Biology, 2005, 12(6):44-46.)

[23] 王颖, 张笛, 茹加, 等. 壳聚糖固定化漆酶酶学性质及其催化氧化水中2,4-二氯酚的效能与途径[J].环境化学, 2013, 32(10):1901-1907.(WANG Ying, ZHANG Di, RU Jia, et al. Immobilization of laccase enzymatic properties and catalytic oxidation of 2,4-dichlorophenol in water efficiency and the ways[J].Environmental Chemistry, 2013, 32(10):1901-1907.)

[24] GHOSH J P, TAYLOR K E, BEWTRA J K, et al. Laccase-catalyzed removal of 2,4-dimethylphenol from synthetic wastewater: Effect of polyethylene glycol and dissolved oxygen[J].Chemosphere, 2008, 71(9):1709-1717.

[25] JOSÉE-ANNE M, SATINDER K B, RAJESHWAR D T.Laccases for removal of recalcitrant and emerging pollutants[J].Bioresource Technology, 2010, 101(7):2331-2350.

Application of Immobilized Laccase in Diesel Degradation of Circulating Water

LIU Fang, ZHANG Shuang, LÜ Yucui, FAN Fengtao, LU Jinjin, ZHAO Chaocheng, WANG Yongqiang, SUN Juan

(CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityofPetroleum，Qingdao266555，China)

Abstract：The laccase was immobilized by embedding method, crosslinking method and embedded-crosslinking method, respectively. The enzymatic properties of immobilized laccase and free laccase were comparatively investigated. The diesel was selected as the petroleum product. The immobilized laccase prepared by optimal method was used in cooling circulating water with diesel leakage in order to investigate its effect on the diesel removal. The results showed that among the activities of the three immobilized laccase, the one prepared by crosslinking method was the highest (0.66 U/g), while the one prepared by embedding-crosslinking method was the lowest (0.38 U/g). The pH value stability and thermal stability of laccase were all enhanced by immobilization. In 100 mL circulating water containing diesel mass concentration of 120 mg/L and with the pH value of 6, addition of 9 g immobilized laccase and reacted for 6 h, the diesel removal ratios were 77% and 24%, respectively, of the immobilized by crosslinking method and embedding method.

Key words：laccase； immobilization； activity； circulating water； petroleum； degradation

收稿日期：2015-03-30

基金项目：国家自然科学基金项目(21077133)资助

文章编号：1001-8719(2016)03-0637-08

中图分类号：TQ085

文献标识码：A

doi:10.3969/j.issn.1001-8719.2016.03.027

通讯联系人： 刘芳，女，教授，博士，从事水污染控制方面的研究；E-mail:liufangfw@163.com