Cd2+急性胁迫下方格星虫体腔液消化酶活力和游离氨基酸的变化

董兰芳 张 琴 曾梦清 许明珠 童 潼（广西壮族自治区海洋研究所，广西海洋生物技术重点实验室，北海 536000）

Cd2+急性胁迫下方格星虫体腔液消化酶活力和游离氨基酸的变化

董兰芳 张 琴 曾梦清 许明珠 童 潼
（广西壮族自治区海洋研究所，广西海洋生物技术重点实验室，北海 536000）

摘要：为了解Cd2+急性胁迫下方格星虫体腔液消化酶活力和游离氨基酸的变化规律，采用毒理学试验方法，在确定Cd2+对方格星虫毒性强度的基础上，选取48h最低致死浓度为试验浓度，研究该浓度Cd2+胁迫下方格星虫体腔液消化酶活力和游离氨基酸的动态变化。结果表明:方格星虫死亡率随着Cd2+浓度的升高而增加，Cd2+对方格星虫的24h和48h的LC50分别为37.80和22.68 mg/L。在48h最小致死浓度下，Cd2+对方格星虫体腔液蛋白酶和淀粉酶活力在试验周期内均表现为抑制，且淀粉酶活力受到的抑制作用较强； Cd2+胁迫前期脂肪酶活力显著升高（P<0.05），24h后又显著降低（P<0.05），48h时仅为初始水平的40%，说明低浓度Cd2+对脂肪酶活力有诱导作用，高浓度Cd2+则产生抑制。方格星虫体腔液游离氨基酸的组成和含量在Cd2+胁迫48h内均有显著变化（P<0.05）。各游离氨基酸含量及氨基酸总量在24h前均无显著变化（P>0.05），24h后先上升后下降（P<0.05），36h的游离氨基酸总量达到初始水平的2倍以上，为145.50 mg/100 mL，大部分游离氨基酸组成百分比也在24h前较稳定，24h后呈现峰值变化。总之，Cd2+急性胁迫对方格星虫体腔液消化酶活力和游离氨基酸均有显著影响（P<0.05），且消化酶活力与游离氨基酸含量和组成的变化与胁迫时间有关。

关键词：方格星虫； 镉； 体腔液； 消化酶； 游离氨基酸

重金属是常见的环境污染物，能引起生物机体神经中毒，影响其繁殖与生存［1］。镉是毒性最强的重金属之一，广泛应用于电镀工业、化工业、电子业和核工业等领域，大量镉通过废气、废水、废渣等形式排入环境，造成污染。镉有一个很长的生物半衰期（在人体中约20—30年），且进入机体的镉能长期贮存而不易排泄［2］。联合国环境规划署（DNFP）已把镉列为12种全球性环境污染物之首，世界卫生组织（WTO）则将其作为优先研究的食品污染物［3］。

重金属能够抑制水生生物的酶活，妨碍机体的代谢，还会造成生理生化指标的改变，严重时将导致死亡［4］。近年来关于重金属镉对水生动物生长发育及生理生化影响的报道有很多，且主要集中于抗氧化酶、氧化损伤等相关的方面［5—7］。消化酶直接影响机体对营养物质的消化吸收，通过分析消化酶活力的变化可进一步了解生物机体的代谢状况和对环境的适应程度。Brafiel等［8］的研究发现Cd2+胁迫28d后河蚬的纤维素酶活性与Cd2+浓度呈显著负相关，并因此认为消化酶可以作为重金属镉污染的生物标记物。陈肖肖等［9］的研究表明环境Cd2+对泥蚶淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性都有明显的影响作用。氨基酸既是酶类物质合成的前体，同时对生物机体的营养代谢、信号传导、基因表达等起调控作用，研究重金属胁迫下机体氨基酸的动态变化，有助于对生物体防御重金属的机制有一个更深层次的理解。

“碧海蓝天”曾是广西北部湾引以为豪的生态品牌，但近年来随着北部湾经济区开发的推进，北部湾近海海域环境受到影响。2010年的调查数据显示，北部湾近岸海水Cd2+含量范围为0—0.54 μg/L，Cd对海洋生态系统潜在危害的影响程度仅次于Hg和As［10］。方格星虫（Sipunculus nudus，S.nudus），俗称沙虫，是北部湾海水养殖最具特色的海珍品种之一。因其较固定地生活在沿海滩涂的泥沙底质中，以沉积物中的有机碎屑为食，因而对生长环境的变化十分敏感，有“环境标志生物”之称。本研究在确定Cd2+对方格星虫毒性强度的基础上，选取48h最低致死浓度为试验浓度，研究该浓度Cd2+胁迫下方格星虫体腔液消化酶活力和游离氨基酸的动态变化，以期为开展方格星虫健康养殖提供科学依据，同时为探究底栖动物的重金属毒害机制以及由重金属镉引起机体一系列生理生化的变化过程提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

试验用方格星虫来源于广西海洋研究所育苗场，挑选规格基本一致、健康活力好的个体，平均质量（1.68±0.42）g，体长4.5—6.1 cm，于铺有消毒沙子的塑料箱中暂养7d，期间每日喂食1次，试验前1天停止投喂。

仪器设备:超低温冰箱（Haier DW-86L626，青岛）、高速冷冻离心机（Thermo KR25i，美国）、氨基酸分析仪（Sykam S-433D，德国）、超纯水机（Millipore Milli-Q Biocel，美国）。

主要试剂:茚三酮，德国进口分装； 柠檬酸、柠檬酸三钠、氢氧化钠、乙酸钠、乙酸钾、氢氧化锂、甲醇、辛酸购于天津科密欧； 氯化镉、盐酸、乙醇、抗坏血酸、磺基水杨酸等均为国产分析纯，试验前氯化镉用超纯水配成Cd2+浓度为10 g/L的母液，试验时用过滤海水稀释成所需浓度。

试验条件:试验用水为过滤海水，水温（29±1）℃，盐度2.46%，pH 7.72。试验在40 cm× 25 cm×20 cm塑料箱中进行，每个塑料箱内放入2 kg经消毒的沙子（试验前用对应浓度Cd2+海水溶液浸泡过夜，以消除Cd2+在海水和沙子之间的分配导致海水Cd2+浓度变化），每箱盛Cd2+海水溶液6 L，每个试验组放入健康活力好的方格星虫30条，并设置3个平行处理。试验期间，连续充气，不投饵，每24h换水一次。

1.2 试验方法

方格星虫Cd2+急性毒性试验 根据预实验确定Cd2+对方格星虫24h最大致死浓度和48h最小致死浓度分别为100和5 mg/L，按照等对数间隔设置5个浓度梯度组（5、10.57、22.36、47.29和100 mg/L）和一个空白对照组。在试验过程中随时捞出死亡个体，观察并记录各方格星虫组24h和48h的死亡个体数。死亡的标准为身体松软，吻部伸出，对外界刺激没有反应，放入到自然海水中不能复活。

用直线内插法，以浓度的常用对数为横坐标，死亡率概率单位为纵坐标，求出半致死浓度（LC50），并由公式:A=48h LC50×0.3/（24h LC50/48h LC50）计算出方格星虫对Cd2+安全浓度［11］。

Cd2+急性胁迫对方格星虫体腔液消化酶活力和游离氨基酸的影响试验 试验选取Cd2+对方格星虫48h最小致死浓度即5 mg/L为试验组浓度，以保证大多数方格星虫能够存活。挑选健壮的方格星虫30条，随机选取4—5条用纯水冲洗后滤纸吸干水分，再用剪刀剪个小口子收集体腔液，混匀后用1.5 mL离心管分装成两管分别用于消化酶活力和游离氨基酸含量的测定，剩余的方格星虫在5 mg/L Cd2+浓度下进行攻毒实验。分别在12h、24h、36h和48h，随机选取4—5条方格星虫用纯水洗净拭干后进行活体解剖，用同样的方法收集体腔液并分装。试验设置3个平行处理，及时捞出死亡个体。

体腔液消化酶活力测定 体腔液解冻后于4℃、4000 r/min离心15min，取上清液用于消化酶活力的测定。蛋白酶活力的测定采用Folin-酚法；脂肪酶活力和淀粉酶活力的测定采用南京建成生物工程研究所研制的试剂盒。体腔液蛋白质量分数以牛血清蛋白作标准，用考马斯亮蓝法测定。

体腔液游离氨基酸测定 用移液枪取800 μL方格星虫体腔液于1.5 mL离心管中，加入200 μL 10% 磺基水杨酸，充分摇匀，置于4℃冰箱中存放30min以上，取出后离心10min，取上清液，用仪器所配样品稀释液（0.12 mol/L pH 2.2柠檬酸锂溶液）按1∶1溶解，最终样品的pH应在pH 1.80—2.00，必要时可用浓缩的LiOH调整。上述溶液用0.22 μm针式过滤器过滤后，上氨基酸自动分析仪测定。

1.3 数据分析

采用SPSS 19.0对所得数据进行处理，先用Levene's test做方差齐性检验后再做单因素方差分析，若差异达到显著（P<0.05），则用Duncan's多重法比较各组数据之间的差异，结果用平均值±标准误表示，重复数n=3。

2 结果

2.1 Cd2+对方格星虫的急性毒性

Cd2+对方格星虫的急性毒性的试验结果

表 1为方格星虫死亡率与Cd2+浓度及时间的关系。随着Cd2+浓度的升高，方格星虫死亡率称呈上升趋势。在相同Cd2+浓度下，随着时间延长，死亡率升高。高浓度Cd2+组的方格星虫中毒反应明显且迅速，短期内星虫就开始剧烈扭动，随着时间的增长吻部变细、颜色变深，活力慢慢下降，最后身体膨胀、变软，触手伸出，吻部形成紫色团状物，对外界刺激没有反应，即死亡。而低浓度Cd2+组的方格星虫中毒反应较高浓度组慢，剧烈扭动不久便钻入沙子，经过较长时间才出现死亡，死亡症状与高浓度组相同。

表 1 Cd2+对方格星虫急性毒性试验结果Tab.1 The effect of acute toxicity of Cd2+on mortality

Cd2+浓度与死亡率的回归分析 通过对Cd2+浓度对数-死亡率的回归分析（表 2），显示出较好的拟合度（R>0.78）［12］，这表明方格星虫受Cd2+胁迫的致死率与Cd2+浓度密切相关。其24h和48h 的LC50分别是37.80和22.68 mg/L，安全浓度是2.45 mg/L。

2.2 Cd2+急性胁迫后方格星虫体腔液消化酶活力的变化

如图 1所示，在Cd2+急性中毒后，方格星虫体腔液蛋白酶活力在12h内显著下降了10.94%（P<0.05），12h至48h时间段内活力保持稳定，没有显著变化（P>0.05）。这说明Cd2+对方格星虫体腔液蛋白酶活力起一定的抑制作用。

在Cd2+胁迫下，体腔液脂肪酶活力的变化与蛋白酶不同，12h内脂肪酶活力显著升高（P<0.05），12—24h有一定升高但不显著（P>0.05），24h后脂肪酶活力开始显著降低（P<0.05），32h时的脂肪酶活力约为初始活力58%，48h时仅为初始水平的40%。这说明低浓度Cd2+对脂肪酶活力有诱导作用，而当Cd2+达到一定浓度后对脂肪酶活力有较强的抑制作用。

Cd2+对方格星虫体腔液淀粉酶活力起抑制作用，其变化规律与蛋白酶相似，显著下降（P<0.05）后趋于稳定。但淀粉酶活力受Cd2+的影响较蛋白酶大，12h时活力约为初始水平的72%，24h时仅为58%，24h以后淀粉酶活力有一定回升，但变化不显著（P>0.05）。

2.3 Cd2+急性胁迫下方格星虫体腔液游离氨基酸的变化

游离氨基酸总量的变化 Cd2+急性胁迫对方格星虫体腔液游离氨基酸总量的影响如图 2所示，24h内体腔液游离氨基酸总量无显著变化，24—36h游离氨基酸总量显著上升（P<0.05），36h又显著下降（P<0.05）至初始水平，36h的游离氨基酸总量达到初始水平的2倍以上，为145.50 mg/100mL。

各游离氨基酸含量的变化 Cd2+急性胁迫48h内方格星虫体腔液各游离氨基酸含量的变化见表 3。本研究共测定了17种氨基酸，其中胱氨酸和苯丙氨酸未检出。48h内15种氨基酸中除丝氨酸、蛋氨酸和亮氨酸外，其他氨基酸含量的变化都有显著差异（P<0.05），且均在36h时达到最大值，48h时恢复初始水平。天冬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、精氨酸和脯氨酸含量在24h前无明显变化，24h后开始显著上升（P<0.05）； 谷氨酸、酪氨酸和组亮氨酸含量则在12h以后就开始上升，24h后上升显著（P<0.05），40h后又显著下降（P<0.05）至初始水平； 而甘氨酸和赖氨酸的含量，在Cd2+急性胁迫后的12h内有所下降但不显著，后一段时间同其他氨基酸含量一样呈先升高后降低（P<0.05）至初始含量水平的趋势。

各游离氨基酸组成的变化 表 4显示Cd2+急性胁迫后方格星虫体腔液游离氨基酸组成百分比的变化有一定的规律性。丝氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸含量占氨基酸总量百分比在48h内没有显著变化（P>0.05）； 天冬氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸和精氨酸含量百分比在24h前无显著变化（P>0.05），24h后显著下降（P<0.05）后又显著上升（P<0.05）； 丙氨酸和脯氨酸则相反，24h前无显著变化（P>0.05），24h后显著上升（P<0.05）再显著下降（P<0.05）； 谷氨酸百分比在24h前就已经开始显著增加（P<0.05），24h后显著下降后又上升（P<0.05）。

表 2 死亡率与Cd2+浓度对数的回归分析Tab.2 Regression analysis between the death and concentration logarithm of Cd2+

图 1 Cd2+急性胁迫下方格星虫体腔液消化酶活力的变化

图 2 Cd2+急性中毒方格星虫体腔液游离氨基酸总量的变化

3 讨论

3.1 Cd2+对方格星虫的急性毒性及安全评价

研究表明Cd2+通过与酶类巯基、羟基和氨基的结合或置换出酶中金属，使其活性降低或失去功能［13］； Cd2+也能引起DNA单链断裂，抑制DNA聚合酶β的活性，导致细胞凋亡［13］。Cd2+对水生动物如鱼虾类、贝类等都有较高毒性。Cd2+对瓦氏黄颡鱼、鲫、草鱼、军曹鱼和克氏原螯虾的48h LC50分别是59.14、8.68、34.81、19.87和8.31 mg/L［14—18］，对文蛤、海湾扇贝、四角蛤蜊和方斑东风螺的48h LC50分别是2.243、4.52、5.146和13.86 mg/L［19—22］。另外，陈细香等［23］的研究得出了Cd2+对可口革囊星虫的48h LC50是10.69 mg/L。在本研究中方格星虫死亡率与Cd2+浓度呈正相关，即随着Cd2+浓度的升高，死亡率增加，其24h和48h 的LC50分别是37.80和22.68 mg/L，相同时间的半致死浓度较上述瓦氏黄颡鱼和草鱼小，与军曹鱼的半致死浓度相近，是可口革囊星虫半致死浓度的两倍左右，说明方格星虫对镉的耐受力相对较强，较同属星虫动物门的可口革囊星虫耐受更高浓度的Cd2+。

3.2 Cd2+急性胁迫对方格星虫体腔液消化酶活力的影响

消化酶是营消化作用的水解酶类，其活性可以指示动物的代谢状态及其对外界环境的适应程度［24］。Cd2+等重金属离子进入机体后，以不同的方式与底物、酶的活性产物及酶本身产生极强的亲和力，从而导致酶活性改变，有些能对酶活产生抑制，有些则能激发酶的催化功能［25，26］。陈细香等［23］研究Cd2+等四种重金属离子对可口革囊星虫纤维素酶、淀粉酶和脂肪酶活力影响的结果表明，纤维素酶和淀粉酶活力随Cd2+浓度升高而降低，脂肪酶活力的变化趋势则相反且各处理组的酶活均显著高于对照组。红树蚬用不同浓度水平的Cd2+处理不同的时间后发现:Cd2+对其胃组织淀粉酶活力基本表现为抑制，仅在0.125 mg/L处理组表现为小幅度的诱导； 对其蛋白酶活力的影响效应规律性不明显； 而在胁迫初期脂肪酶活力受到显著诱导，随着时间延长酶活性下降［27］。不同浓度Cd2+对青蛤的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力均表现为不同程度的抑制［28］。

本研究结果表明，Cd2+对方格星虫体腔液蛋白酶和淀粉酶活力的影响与上诉研究结果相似，均表现为抑制作用，而脂肪酶活力在Cd2+胁迫初期显著被诱导，随着时间延长酶活力又受到了显著的抑制，这与Cd2+胁迫下红树蚬脂肪酶活力变化规律一致。

3.3 Cd2+急性胁迫对方格星虫体腔液游离氨基酸的影响

方格星虫体腔液中含有许多游离氨基酸，这些氨基酸除了用于合成蛋白质、多肽及转化成其他含氨物质外，还参与一些特殊的生理代谢反应，对方格星虫的生命活动有重要作用。研究已表明金属硫蛋白在机体对镉的解毒机制中起关键作用［29］，氨基酸作为合成体内金属硫蛋白的代谢底物，研究Cd2+胁迫下方格星虫体腔液中游离氨基酸含量的变化，可以在一定程度上反映镉在机体内的流转动态，侧面了解机体的解毒过程。然而，目前关于Cd2+胁迫对生物体内游离氨基酸影响的报道较少。谢春等［30］研究了多代镉胁迫对家蝇幼虫血淋巴中游离氨基酸含量的影响，结果显示:与对照组相比，镉胁迫组家蝇3日龄幼虫血淋巴中生糖氨基酸总量降低； 镉胁迫10代组生酮氨基酸总量及赖氨酸浓度均升高，丙氨酸浓度降低； 镉胁迫1和10代组游离氨基酸总量未见明显变化。Wu等［31］对镉胁迫下两种基因型大麦的游离氨基酸等变化的研究中发现，在培养基中添加Cd2+能够显著改变大麦组织中的游离氨基酸含量和组成，其中根部的游离氨基酸含量随着Cd2+添加量的增加而显著增加，而在添加5 μmol/L Cd2+时茎和叶中的游离氨基酸含量显著降低。

表 3 Cd2+急性胁迫后方格星虫体腔液游离氨基酸含量的变化Tab.3 The content of eachfree amino acid in S.nudus coelomic fluid after acute poisoning by Cd2+（mg/100mL）

表 4 Cd2+急性胁迫后方格星虫体腔液各游离氨基酸占氨基酸总量百分比的变化Tab.4 The free amino acid composition in S.nudus coelomic fluid after acute poisoning by Cd2+（%）

在本研究中5 mg/L Cd2+胁迫48h内方格星虫体腔液游离氨基酸的含量和组成均有显著变化。各游离氨基酸含量及氨基酸总量在Cd2+胁迫24h内均无显著变化，其中甘氨酸、赖氨酸等含量稍有下降，已有的研究表明重金属能与生物体内的甘氨酸、ATP等结合形成络合物［19］，因此胁迫初期少量Cd2+进入体内与氨基酸直接结合或通过形成螯合肽参与重金属解毒造成了部分游离氨基酸的消耗。24h以后各游离氨基酸含量先显著上升后显著下降，且大部分氨基酸占总量的百分比出现显著变化，出现这种变化的原因可能是随着更多Cd2+进入体内，机体金属硫蛋白等解毒物质被Cd2+饱和，在Cd2+的诱导下其他组织蛋白分解成大量的游离氨基酸，用以合成金属硫蛋白、螯合肽等物质来结合Cd2+，从而达到解毒目的。另外，重金属对谷胱甘肽转移酶、超氧化歧化酶等机体解毒代谢酶活力也有明显的诱导或抑制分泌的作用［32］，这些过程都能引起游离氨基酸的含量和组成发生改变。游离氨基酸这一快速增加继而恢复初始水平的过程说明了方格星虫对体腔液游离氨基酸含量的动态平衡具有良好的自我调节能力。

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CHANGES OF DIGESTIVE ENZYME ACTIVITIES AND FREE AMINO ACIDS IN SIPUNCULUS NUDUS COELOMIC FLUID UNDER ACUTE STRESS OF CD2+

DONG Lan-Fang，ZHANG Qin，ZENG Meng-Qing，XU Ming-Zhu and TONG Tong
（Key Laboratory of Marine Biotechnology of Guangxi，Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，China）

Abstract:The current study investigated the acute toxicity of Cd2+to Sipunculus nudus Linnaeus using toxicological methods.To do this，the peanutworms were exposed to Cd2+stress for 48h at minimum lethal concentration，and the dynamic changes of digestive enzyme activities and free amino acids in their coelomic fluid were analyzed.The results showed that the mortality of peanutworms increased with the increasing Cd2+concentration.The LC50of Cd2+after 24h and 48h were 37.80 mg/L and 22.68 mg/L，respectively.Cd2+exposure had inhibitory effects on protease and amylase activities in coelomic fluid during the whole experimental period.The lipase activity increased（P<0.05）at the early time of the exposure，but inhibited significantly（P<0.05）after 24h.The content and composition of free amino acids in coelomic fluid of peanutworms had significant changes during the 48 hours.Each free amino acid and the total amino acid had no significant changes（P>0.05）at the first 24 hours，and then the contents of that increased significantly（P<0.05）and decreased significantly later at the next 24 hours（P<0.05）.The total amino acid reached 145.50 mg/ 100 mL at 36h，twice as initial level.The free amino acids composition had a similar regulation pattern with total amino acid.No significant change was observed at first 24h and then reached peak level after that.The results suggest that acute stress of Cd2+significantly impact digestive enzyme activities and free amino acids in Sipunculus nudus coelomic fluid with a time-dependent pattern.

Key words:Sipunculus nudus； Cadmium； Coelomic fluid； Digestive enzyme activities； Free amino acid

中图分类号：Q958.11

文献标识码：A

文章编号：1000-3207（2016）03-0524-08

doi:10.7541/2016.70

收稿日期：2015-07-08；

修订日期：2015-12-11

基金项目：广西科学研究与技术开发计划课题（桂科合1346011-12，桂科攻14121006-2-12，桂科合14125008-2-20）； 广西自然科学基金（2015 GXNSFBB139005）； 国家自然科学基金项目（31402304）资助［Supported by Science and Technology Development Program of Guangxi Zhuang Autonomous Region（1346011-12； 14121006-2-12； 14125008-2-20）； Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region（2015GXNSFBB139005）； National Natural Science Foundation of China（31402304）］

作者简介：董兰芳（1987—），女，浙江金华人； 本科，助理研究员； 研究方向为水产动物营养生理与养殖生态学。E-mail:0xiao0dong0@163.com

通信作者：张琴，博士，副研究员，硕士生导师； E-mail:zhangqin821220@163.com