野生圆口铜鱼卵巢成熟内分泌信号表达分析

夏雨果陈晓文贺江燕刘家寿殷 战（.中国科学院水生生物研究所水生生物多样性与保护重点实验室，武汉 430072； 2.中国科学院大学，北京 00049）

野生圆口铜鱼卵巢成熟内分泌信号表达分析

夏雨果1，2陈晓文1贺江燕1刘家寿1殷 战1
（1.中国科学院水生生物研究所水生生物多样性与保护重点实验室，武汉 430072； 2.中国科学院大学，北京 100049）

摘要：圆口铜鱼（Coreius guichenoti）是一种呈群同步发育繁殖的鱼类，对其卵巢成熟各时期特征分析，可进一步了解鱼类卵巢成熟的分子调控机制，并为人工催产实践提供理论支持。研究以野生雌性圆口铜鱼不同发育时期的卵巢为研究对象，通过现场卵巢解剖观察以及实验室内组织学分析，收集处于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的卵巢组织样本进行转录组分析。研究显示野生圆口铜鱼卵巢组织在其成熟发育各阶段具有明确的组织学和转录表达特征。研究采用全序列转录组测序分析，以鲤科模式鱼类斑马鱼的基因序列作为主要参考序列，共检测得到11495 bp基因片段。聚焦内分泌/自分泌信号分子的转录表达，发现促乳素（Prolactin，prl）、卵泡刺激素（Follicle-stimulating hormone，fsh）、雌激素（Estrogen）、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）合成酶类、生长/分化因子9（Growth/differentiation factor 9，gdf9）、激活素（Activin）、和抗穆氏管激素（Anti-Müllerian hormone，amh）等转录表达和卵巢发育成熟呈现出显著的关联动态变化。通过对样品中卵巢成熟诱导激素（Maturationinducing hormone，MIH）合成酶分子的表达水平的观察，发现涉及MIH的17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one的合成酶分子表达水平较高，而另一种MIH分子11-deoxycorticosteron的合成酶的表达水平处于检测水平之下，因此，提示17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one可能是圆口铜鱼卵巢成熟后期的主要促进因子。同时，发现了完整的胆酸合成酶系列分子在卵巢转录组中的存在，这是鱼类卵巢组织中具有合成胆酸能力的首次报道，其生理作用有待进一步研究。总之，作为一种群同步发育的鱼类，此项研究为鱼类卵巢成熟发育过程中的内分泌信号调控网络提供了大量的数据参考。

关键词：圆口铜鱼； 卵巢成熟； 转录组测序分析； 内分泌/自分泌信号

大部分的硬骨鱼类都属于卵生动物，在雌性生殖系统中产生卵黄，并伴随着卵成熟的发育过程。硬骨鱼类雌性卵巢的发育过程存在多样性，包括同步发育（单批产卵）、群同步发育（分批产卵）和异同步发育（连续产卵）类型。对于同步发育类型的鱼类，卵细胞同步发育并一次性产完所有的卵，所有的卵粒在短期内排出。而对于群同步发育的类型，在繁殖的卵巢内，至少存在着两个发育阶段的卵粒。在繁殖季节，这些卵粒发育至成熟，之后分几个批次成熟排出。对于异同步发育类型的鱼类，卵巢中包含着各种不同发育阶段的卵泡，并能在全年任何阶段产卵。尽管繁殖策略存在多样化，但是在卵母细胞的发育成熟过程中，总是伴随着一些共同的形态学和生理学特征的变化［1］。生殖腺的发育过程也是一个动态的过程，这个过程包含着许多与组装和修饰细胞组成的相关因子之间的协作调控，用以支持配子的发育。这个过程是通过大量的结构和功能的转变来完成的，包括初级卵母细胞形成、卵黄形成、卵母细胞成熟及生发泡破裂（Germinal vesicle breakdown，GVBD）。许多早期的研究关注了内分泌、旁分泌因子对鱼类卵巢发育的调控及影响，近年来，转录组学分析技术的应用为研究不同繁殖策略的硬骨鱼类卵巢发育及排卵的分子调控机制提供了宝贵的方法［1，2］。迄今为止，有关卵巢发育的转录表达的工作较多地在模式鱼类，如斑马鱼（Danio rerio）、鲦（Pimephales promelas）［3，4］，由于这些模式鱼类均为非同步发育卵的代表，因此难以开展对不同成熟时期的卵巢特征的研究。尽管近期在养殖鱼类，如花条鲈（Morone saxatilis）、橄榄比目鱼（Paralichthys olivaceus）等也有关于卵巢转录组研究报道，但这些研究或者采用的定量效率较弱基因芯片技术、抑或是各期卵巢的混合样品，其关注的依然是卵巢器官特异基因表达的特性分析，而非对不同成熟期的卵巢转录特征进行分析［5，6］。

圆口铜鱼（Coreius guichenoti），广泛分布于长江的上游地区，是一种重要的经济淡水鱼类。圆口铜鱼的幼鱼会在长江的重庆至宜宾江段生活3—4年，之后逐步上溯600—1000 km至水流湍急及水温更低的上游江段。成鱼（体重约500—2000 g）群体生活于长江的上游江段，并在每年的4—7月进行产卵活动。近年来，长江上游包括三峡大坝、溪洛渡大坝和向家坝的建设，导致这种洄游性鱼类种群资源受到了威胁。近来，关于圆口铜鱼的人工养殖已经开展了一些工作，目的在于一方面保护野生鱼类群体，另一方面以期未来能继续利用具有重要经济价值的鱼类。然而，由于圆口铜鱼的养殖过程中病害造成的大量损失，以及圆口铜鱼相对长的成熟周期，使在网箱中饲养的圆口铜鱼很难发育至性成熟期。因此，圆口铜鱼苗种的获得面临困难，随着在原有圆口铜鱼成熟江段可以获取的野生成熟雌性群体不断下降，研究圆口铜鱼的催熟技术以推动人工繁殖的发展已经迫在眉睫。

本研究采用以转录组分析为基础的方法来探讨圆口铜鱼卵巢成熟过程中的分子特征。RNA-seq（转录组测序分析）是转录组研究的新方法，它为基因组序列信息不完善的非模式生物的转录组学分析研究提供了可能［7］。本研究采用这种方法研究圆口铜鱼卵巢发育过程中各个发育阶段的基因表达特征，将增加对硬骨鱼类卵母细胞发育过程的基因表达与调控网络的理解，该项研究结果也将为针对各卵巢发育阶段提供潜在的、能应用于水产养殖的分子标记奠定基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集与保存

成熟的雌性圆口铜鱼样品的采集时间为2012和2013年的4—5月，采集地点云南省华坪县，位于金沙江中、下游，采样工具为滚钩、饵钩。采集的鱼类样品，用麻醉使其昏迷，测量全长（mm）、体重（g）、性腺重（g）。性体指数GSI（Gonadosomatic index），计算公式如下:GSI=性腺重/体重×100%。取部分卵巢样品保存于波恩溶液中，用于之后的组织学分析。部分样品保存于RNAlater溶液中（AM7020，Life Technologies），用酒精擦拭过的剪刀将RNAlater溶液中样品剪碎，并迅速冷冻保存用于提取RNA。所有野生样品的采集得到云南省农业部门许可。

将波恩溶液中固定的卵巢组织样本包埋在石蜡中并切成6—12 µm的连续切片。卵巢的染色利用标准的苏木精和伊红溶液。圆口铜鱼的卵巢分期参见Selman［8］，将卵巢分为5个时期。在卵巢分期的任何一个阶段，卵巢表现出异质性，包含了不同发育阶段的卵粒。卵巢分期基于最成熟的卵母细胞阶段，在10倍和40倍显微镜下进行分辨。选取代表性的发育期Ⅲ期（卵黄形成期）、Ⅳ期（卵母细胞成熟期）和Ⅴ期（排卵期或成熟卵期）雌鱼各1尾，取卵巢样品进行转录组测序分析。

1.2 RNA提取及纯化

RNA提取采用RNeasy Mini Kit（Qiagen）试剂盒，提取RNA后用RNase-free DNaseⅠ（Qiagen）处理去DNA。用Agilent 2000分析仪检测RNA大小和完整性。采用PolyATract mRNA（Promega，Madison，WI，USA）分离纯化mRNA。由反转录酶和随机引物将片段化的mRNA合成cDNA第一链，第二链的合成则使用DNA polymerase Ⅰ和RNase H。用核酸外切酶和聚合酶进行末端修复、连接接头，分离纯化，PCR扩增创建cDNA文库，采用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System进行文库质检。

1.3 转录组分析

转录组测序采用Illumnima HiSeqTM2000，95 bp双向测序。原始数据（Raw reads）通过去除接头和低质量序列后，采用SOAPaligner/soap2将原始数据比对到斑马鱼基因组序列上，允许两个以上碱基不匹配（Zebrafish genome assembly version 9，Zv9； http:// www.sanger.ac.uk）。比对完后，统计reads在参考序列上的分布及覆盖度，判断比对结果并进行质控。运用Trinity软件（http://trinityrnaseq.sourceforge.net）进行组装拼接，得到转录本序列。为了利于样品间转录水平的比较，每个文库标准化的基因表达水平用RPKM（Reads Per kilo-base per Million reads）表示。确定基因转录活性的阀值是基于每个基因RPKM值的95%置信区间。GO（Gene Ontology，基因聚类）功能注释使用软件Blast2GO（version 2.3.5）（http:// www.blast2go.org/）进行。KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析使用带ClueGO插件（http://www.ici.upmc.fr/cluego/cluegoDownload.shtml）的Cytoscape软件（version 2.6.2）（http://www.cytoscape.org/）进行。样本之间RPKM值变化倍数为2倍及以上的基因认为有差异表达。

1.4 实时定量PCR

为了验证RNA测序结果，选取9个与繁殖相关的基因通过荧光实时PCR确定其在3个发育期（各1尾样本）中的表达水平。本实验在2014年圆口铜鱼繁殖季节，自金沙江上游野外再采获卵巢发育处于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的雌鱼各一尾，作为实时荧光定量PCR验证的样品，提取总RNA。总RNA用RevertAid ™First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas）反转录合成cDNA第一链，引物采用oligo（dT）。PCR反应体系（20 µL）:SYBR绿色荧光染料Mix（Toyobo，Osaka，Japan）10 µL，引物0.25 µL，cDNA模板1 µL。选用glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（gapdh）作内参，计算mRNAs的相对表达量。检测重复3次，每次设3个复孔，3次重复测量的值变异系数小于5%被认为有效。不同样品的表达水平采用变化倍数（Mean±SE）来表示，设第Ⅲ期为对照，即第Ⅲ期样品的值均设为1倍。实验中引物设计见表 1。

2 结果

2.1 卵巢样品的组织学特征

圆口铜鱼的产卵主要是4或5龄雌性个体在4—5月或7月进行。在卵巢组织样品的组织学特征观察之后，选取样品H6007、H6003和H5006用于之后的转录组研究。3个样品的基本信息见表 2。所选取的每个圆口铜鱼卵巢样品的代表性显微图像见图 1。卵黄生成期（Ⅲ期）的特点是卵黄明显沉积，且周围有大量油滴形成。卵母细胞成熟期（Ⅳ期）的特点是液泡逐渐消失，细胞质内卵黄增加，逐渐形成同质的细胞质。排卵期（Ⅴ期）特点是生发泡破裂（GVBD）及消失，切片观察可发现染色的卵母细胞数量明显减少。随着卵巢的发育成熟，GSI也从2.1%增加到6.1%，这和其他关于硬骨鱼类的研究结果是相符合的［8］。圆口铜鱼所有卵母细胞的发育并非完全同步的，导致样本在转录组分析中部分的发育阶段分子特征发生重叠掩盖，然而，随着发育的进行，每个新的发育阶段还是体现着显著的组织学特征，相信各期所具有的独特表达及组成会依然在转录组中有所体现。因此，选取的H6007（Ⅲ期）、H6003（Ⅳ期）和P5006（Ⅴ期）卵巢组织样品作为转录组学分析对象，将能够反映卵巢成熟各阶段的表达特征。

表 1 实时定量PCR中引物信息Tab.1 Information on the primers that were used for quantitative real-time RT-PCR

表 2 转录组分析的圆口铜鱼样品基本信息Tab.2 Basic data on the three selected largemouth bronze gudgeon ovary samples

2.2 卵巢发育阶段特异性转录组

为了了解圆口铜鱼卵巢成熟的分子基础，本研究对不同发育时期的卵巢样品的转录组进行了比较。Trinity拼接得到47—151个转录本序列，其中共有35—255个转录本序列（74.8%）比对到斑马鱼参考序列中（E value < 1E-5）。3个转录组中，至少有一个RPKM值大于4的转录本序列有13—330个（显著表达转录本），有11—495（86.2%）在斑马鱼参考基因组中有相应的基因描述。

图 1 圆口铜鱼卵巢主要发育期切片图

通过对卵巢组织中的13330个显著表达转录本的分析，我们发现在某一特定时期的基因表达特征与其相邻时期最相似（图 2），表明基因表达谱与卵巢形态发育密切相关。随着卵巢发育的进行，差异表达的转录本数量也明显不同。每个发育期表达的转录本数量venn图（图 2），Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期卵巢共有9992个共同表达转录本，其中Ⅲ期和Ⅳ期卵巢共享11155个转录本，而Ⅲ期和V期则仅共享10299个转录本。如图2所示，随着卵粒的成熟，可检测到的表达转录本数量逐渐减少，由Ⅲ期的12024、Ⅳ期的11832，至Ⅴ期的11172。

通过GO分析和KEGG通路分析，初步评估了参入性腺发育的主要生物学过程。不同样本间发生最显著影响的10个信号途径GO和KEGG分析结果见表 3。这些通路分析结果进一步证实了圆口铜鱼卵母细胞成熟过程与线粒体或细胞代谢、细胞成分合成相关，这与前人研究的其他硬骨鱼类是相似的［9—11］。已有研究报道，Gai蛋白和细胞内cAMP参与孕酮介导的卵母细胞成熟过程［12］。生发泡破裂（GVBD）和细胞核位移过程中，Rho信号起重要作用［13—15］。而在爪蟾（Xenopus）卵巢中，促成熟因子（Maturation-promoting factor，MPF）复合体的激活包括细胞周期依赖性控制蛋白（cdc2，cyclin-dependent control protein 2）和细胞周期蛋白B1（cyclin B1），可调控卵母细胞成熟中生化过程的协调配合［16］。在3个样品中，热休克蛋白90（hsp90，heat shock protein 90）、cdc2，Ringo A和Mos Oocyte Mature Factor（mos）均有较高的表达量。圆口铜鱼卵巢发育期后阶段（Ⅴ期）上调的基因有，膜相关孕激素受体组件（Membrane-Associated Progesterone Receptor Component 2）、细胞质多聚腺苷酸化元件结合蛋白（cpe1，Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding Protein 1）、Cyclin B1和Cyclin A。结果表明MPF和MOS相似的信号途径在卵母细胞成熟过程中起作用。然而由于目前的KEGG软件针对信号通路的分析过于强调病理生理过程，特别是肿瘤学研究，这种聚类分析不完全适合解释卵巢发育过程中的转录组数据，因此，本研究后续利用所获得转录组数据，进一步针对相关的内分泌信号分子的表达特征进行了分析。

图 2 圆口铜鱼卵巢发育过程中表达谱venn图

2.3 内分泌和生长因子信号

圆口铜鱼卵巢为非同步发育，相对于完全非同步发育的斑马鱼卵巢组织，在圆口铜鱼卵巢中相对集中的不同发育时期的卵巢样品是研究硬骨鱼类卵子发生很好的模型。采用RNA-seq测序分析，与信号分子相关的内分泌/旁分泌因子在表 4中列出。从这些分子表达谱可以看出，哺乳动物和鱼类卵巢的分子生物学过程有相似的基本特征。

表 3 不同卵巢样品中差异表达基因的GO聚类分析Tab.3 Gene ontology（GO）analysis of differentially expressed genes in the different ovary samples

硬骨鱼类类固醇激素，如熟知的促成熟激素（MIHs），能调控性腺分化、卵巢发育和卵母细胞成熟［17］。按照现有来自哺乳类或前人在硬骨鱼类中的研究，假定圆口铜鱼卵巢中关键的类固醇合成酶途径见图 3。那么本研究显示在圆口铜鱼卵巢成熟过程中，17β雌二醇的合成途径始终是处于活动状态。另外，前列腺素类，一组脂质类介质，包括前列腺素（PGs），在排卵过程中也起一定调控功能［18］。基于RNA-seq分析，在卵母细胞成熟阶段，与前列腺素E（Prostaglandin E）合成相关的关键酶的表达量在卵巢发育Ⅳ是最高的，而前列腺素F的合成酶则在Ⅴ期达致最高（图 4）。

2.4 圆口铜鱼卵巢胆汁酸主要合成途径

胆汁酸在脂质和胆固醇代谢过程中起着重要的作用，通常胆汁酸在肝胆系统中合成，在胃肠道起作用［19—21］。然而，本研究RNA-seq数据显示，胆汁酸主要合成途径中关键酶的转录本持续出现，如Cyp46A、Cyp7A、Cyp27A和Cyp8b（图 5），与胆固醇合成相关的一些列关键酶的转录本在圆口铜鱼卵巢中均有检得，因此推断硬骨鱼类胆汁酸合成可能在卵巢中也发生。

2.5 实时定量PCR（RT-PCR）验证RNA-seq结果

为了验证RNA-seq分析中发现的一些关键内分泌信号分子的差异表达情况，共选取9个基因设计特异性引物，并采用另外独立采集的3个不同成熟阶段的样本RNA进行验证（表 1）。这些基因的动态表达特征，表明其可能参与卵巢发育成熟过程的调控。RT-PCR的结果显示，这9个基因在不同时期表达水平的变化趋势与RNA-seq结果相同，尽管表达量存在一定差异（图 6）。

3 讨论

作为分批产卵的鱼类，圆口铜鱼的卵巢在不同的发育阶段中，都能观察到异质性的卵巢组织，采取的卵巢样品中，约有30%的卵母细胞处于卵黄形成期。与Ⅲ期样本中卵母细胞群相比，Ⅳ期样品中处于成熟期卵母细胞占约20%。而在Ⅴ期样本的卵巢组织中则出现了超过10%处于排卵阶段的卵母细胞。这些观察表明，在野生圆口铜鱼的卵巢发育过程中，进入后期成熟过程的卵母细胞仅占一部分，即使在出现了超过10%的卵母细胞达致成熟排卵期时，依然有发育至各期的卵母细胞在卵巢中存在，表明圆口铜鱼的群同步性成熟特征。因此也表明我们所选取的样品都将发生各个发育期存在部分重叠的分子特征。然而，我们假定每个新出现阶段的分子特征是可区别的，并且能够反映增加的和叠加的基因表达谱。同时，我们采用的整体卵巢组织取样，也将真实地反映性腺成熟的实际发生过程，包含与生殖细胞交流中的来自生殖腺中的体细胞表达特征。

表 4 卵巢样品中与内分泌信号相关的差异表达基因Tab.4 Differentially expressed genes related with endocrine signaling genes in the ovary samples

图 3 圆口铜鱼卵巢性腺类固醇激素表达变化

图 4 圆口铜鱼卵巢与性腺廿烷酸合成相关的基因表达变化

圆口铜鱼和斑马鱼都同属于鲤科鱼类［22］，由于没有圆口铜鱼全基因组信息，以斑马鱼基因组为参考序列，生物信息学分析显示圆口铜鱼转录本表达水平RPKM值大于4的转录本有86.2%是与斑马鱼转录本高度匹配的，表明我们的分析具有较高的可信度。基于GO聚类分析的KEGG通路分析揭示，圆口铜鱼卵巢样品中差异表达的转录本的信号途径包含:卵巢能量代谢、Gαi信号、胞内cAMP驱动信号和孕酮介导的卵母细胞成熟等与形态变化高度相关的信号途径［12，14—16］。这些观察到的卵巢成熟特征与爪蟾和其他鱼类的前期报道具有共有特征，因此，本研究的RNA-seq和GO分析具有较强的功能分析的可信度。

3.1 内分泌和生长因子信号

内分泌/自分泌信号是机体调控生殖过程的重要信号网络，也是体外可能对圆口铜鱼养殖过程中人工催熟雌鱼实施干预的理论基础，因此，本次分析主要聚焦圆口铜鱼卵巢组织中内分泌/自分泌信号分子的表达特征。和其他脊椎动物一样，硬骨鱼类卵母细胞的生长、成熟及排卵过程受到卵巢外信号和卵巢滤泡内部因子的双重调控，这些因子包括垂体分泌的一些多肽类激素，如促卵泡激素（FSH）、促黄体激素（LH）和催乳素（PRL）［1，23］。这些垂体促性腺激素可以通过循环系统运载至性腺组织，由在该处表达的受体感应从而接受垂体激素的调控，另外来自垂体等中枢内分泌器官的促性腺激素也可以通过调控由身体其他部位，包括性腺组织的类固醇激素生成代谢而间接调节卵泡的发育。例如，有研究表明促卵泡激素（FSH）能够促进卵泡产生17β-雌二醇，后者能够促进卵黄形成和卵母细胞成熟［17］。除了雌二醇外，一些转化生长因子（TGFβ）超家族成员对调控卵母细胞发育和成熟也起重要作用。TGFβ超家族成员主要包括生长分化因子9（GDF9）、骨形态发生蛋白15（BMP15，bone morphogenetic protein 15）、激活素（Activin）、抑制素（Inhibin）和抗苗勒氏管激素（AMH）。以及针对活化素发生抑制作用的TGFβ家族信号的关联分子卵泡抑制素（Follistatin），许多属于TGFβ的信号途径可以活跃地参入对卵巢发育的调节［24—27］。一些其他激素和生长因子，如生长激素类胰岛素生长因子（IGFs）和表皮生长因子（EGF）也被报道在调节卵巢成熟中起作用［28，29］。从圆口铜鱼的分子表达谱可以看出，鱼类卵巢和哺乳动物的分子生物学过程有相似的基本特征。

图 5 圆口铜鱼卵巢中与胆固醇和胆汁酸合成相关的基因表达

3.2 雌激素信号

我们发现圆口铜鱼卵巢成熟过程中，FSH受体的表达量低，且随着发育进程逐渐降低，表明FSH主要在卵巢成熟的早期起作用，有报道表明FSH促进窦卵泡发育，在卵母细胞生长时作用停止［1］。此外，在圆口铜鱼卵巢样品中prl受体的表达量处于相当平稳的水平，有研究报道IGFs（Insulinlike growth factors）与卵泡发育密切相关［11］，而我们也发现igf-2和igf受体以及一些IGF结合蛋白基因（igfbps，IGF-binding protein genes）在圆口铜鱼卵巢成熟过程中均有表达。令人意外的是我们未发现lh受体在成熟过程中的卵巢组织有明显表达，其原因值得探究。

在正常情况下，卵母细胞的成熟过程依赖于卵母细胞和卵泡颗粒细胞间一系列的信号分子的相互沟通和协调。卵母细胞通过合成和分泌卵母细胞特异性因子直接调控其发育及卵泡的生长和分化，如GDF-9和BMP15作用于卵泡颗粒细胞，改变其增殖、功能和分化。研究表明GDF-9缺陷的小鼠（C56BL/6）卵母细胞生长加速，可推断GDF-9参与负反馈调控途径，缓和卵母细胞生长［30］。BMP-15缺失的绵羊（Ovis aries），卵泡发育至第一阶段即停止发育，卵母细胞迅速从有活力的卵泡中消失［31］。在本研究中，检测到圆口铜鱼卵巢中gdf-9和bmp15有一定的表达量，且gdf-9的表达水平在排卵期显著上升（图 6）。这表明硬骨鱼类和哺乳动物可能采用的相似的方式，都是通过卵母细胞中gdf-9和bmp15表达水平的时空变化来调控卵母细胞成熟。激活素与抑制素是TGFβ超家族中两个紧密相关的信号成员，具有相反的生物学功能。激活素能够加强FSH的生物合成和分泌，并参与调节卵母细胞的成熟。卵泡抑素（Fst，Follistatin）不是TGFβ超家族成员，但属于一种激活素结合蛋白，能够抵消激活素活性。在斑马鱼及其他许多脊椎动物卵巢中，卵母细胞发育早期激活素信号网络显著高表达，成熟过程中逐渐下降，然而在排卵期又急剧上升。有报道激活素、抑制素和Fst在斑马鱼卵巢颗粒细胞中表达［27］。然而，激活素、抑制素和Fst转录本在本次研究的圆口铜鱼卵巢中未检测到，一些激活素受体基因和Fst-like-1的表达却能观察到。有趣的是，圆口铜鱼卵巢中激活素Ⅱ型受体（A c t i v i n typeⅡreceptor）的表达量在排卵期显著下降。这些观察结果表明，圆口铜鱼卵母细胞成熟过程中包含一个类似激活素信号的调节效应。AMH是TGFβ超家族另一成员，在小鼠卵巢原始卵泡增殖和优势卵泡选择中起重要作用［24，25］。在本研究中，amh在圆口铜鱼卵巢卵黄形成期有适度表达，在其他时期均处于较低的表达水平（图 6）。这种amh表达量的动态变化可能暗示其在卵母细胞成熟早期阶段一起作用。

图 6 卵巢成熟过程中关键内基因分泌信号转录本的RT-PCR验证结果

在硬骨鱼类卵母细胞生长和成熟过程中，类固醇激素，尤其是雌二醇-17β（Estradiol-17β），通过控制肝脏中卵黄蛋白原的合成来调控卵巢的发育。卵巢为雌二醇-17β合成的主要部位，合成过程受到下丘脑-垂体-性腺轴的调控。estradiol-17β是一种天然的类固醇激素，在卵巢中由胆固醇合成而来［1，17］。鱼类胆固醇的合成途径见图 5。如图 5所示，关键酶的相对表达量，包括限速HMG CoA还原酶在内，在所检测的三个时期中表现出相当稳定的表达水平，这表明在其卵巢成熟各阶段能合成足够丰富的胆固醇资源。而由胆固醇生成雌二醇17β过程中（图 3），需要的所有关键酶转录本均有检测到，只有cyp11a和cyp19a1a的表达水平在三个样品中相对较低。圆口铜鱼卵巢中没有发现cyp11b、cyp21a和hsd17b3转录本，表明在圆口铜鱼中并非依赖11-脱氧皮质酮作为其主要的促生素激素（MIH）作用，此次检测也未发现在圆口铜鱼卵巢中睾丸酮合成途径的存在。这些结果表明，17α，20β-双羟孕酮（17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one）可能是圆口铜鱼卵母细胞成熟过程中主要的促成熟激素。尽管合成雌二醇17β关键酶的表达水平并没有发育时期特异性，但是类固醇合成因子1a（sf-1a，steroidogenic factor 1a）和雌激素相关受体α（errα，estrogen-related receptor α）表达水平在圆口铜鱼卵巢排卵期显著下降。而且，磺基转移酶家族2（sf 2，sulfotransferase family 2）是雌二醇17β代谢的主要代谢酶［32，33］，其表达水平在排卵期卵巢中显著高表达（图 4、图 6）。这些结果表明，在圆口铜鱼卵巢中，雌二醇17β的活性在排卵期可能是下调的。

3.3 雄激素信号

在鱼类卵巢中，前列腺素（PGs）可由廿碳四烯酸（Arachidonic acid）合成。在雌性繁殖过程中，前列腺素被认为是一种重要的中介物质。前列腺素氧化环化酶2（Ptgs2，Prostaglandin-endoperoxide synthase 2； 又名环氧化酶-2，COX-2），能将廿碳四烯酸转化成内过氧化物PGH2，是卵泡中前列腺素合成的限速酶［18，34］。如图 4所示，PGE2合成途径中的所有关键酶都具有相当高的表达水平，而且一些合成酶的转录水平，包括限速酶cox-2在内，在卵母细胞成熟期升高（图 4、图 6）。PGE2生成的阶段特异性可能表明其活跃地参与圆口铜鱼的卵巢成熟过程的调节。

3.4 胆汁酸合成因子

胆汁酸是一种类固醇物质，主要在肝脏中由胆固醇合成。胆汁酸有两条合成途径，经典途径（肝脏）和替代途径（肝外型），已有研究表明这两条合成途径在人类卵巢中均存在［2 0］。圆口铜鱼卵巢KEGG分析表明，在卵巢中存在着胆汁酸合成的两种主要途径的所有关键酶转录本，且没有阶段特异性（图 5）［19—21］。这是首次发现在鱼类卵巢中有胆汁酸的合成，然而，胆汁酸在卵泡中生成的生理学功能有待进一步研究。

利用消减杂交［9，35，36］和寡核苷酸基因芯片［10，11，37］技术，已经对一些硬骨鱼类进行了与阶段特异性的卵巢成熟相关的差异基因表达谱研究。然而，RNA测序是进行全转录组分析的新标准，相比目前的转录组学分析，全mRNA测序展现出更高的准确性和可重复性［7］。迄今为止，还没有关于利用转录组测序对硬骨鱼类卵巢进行分期进行差异基因表达分析的报道。本文利用RNA测序技术对野生的圆口铜鱼卵巢成熟过程进行表达谱分析，并主要聚焦于圆口铜鱼卵巢成熟过程的内分泌/自分泌调控因子，并概括了在卵巢成熟过程中的这些信号的动态表达特征（图 7）。本研究观察为指导圆口铜鱼的卵巢发育的内分泌干预方式提供了依据，一些动态表达的转录本也具有作为识别卵巢发育阶段和卵子获得受精能力的潜在特征性分子标记。

图 7 圆口铜鱼卵巢成熟过程中重要内分泌/自分泌信号基因的动态表达

参 考 文 献：

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ENDOCRINE GENE EXPRESSION PATTERNS ASSOCIATED WITH THE OVARIAN MATURATION OF WILD FEMALE LARGEMOUTH BRONZE GUDGEON（COREIUS GUICHENOTI）

XIA Yu-Guo1，2，CHEN Xiao-Wen1，HE Jiang-Yan1，LIU Jia-Shou1and YIN Zhan1
（1.The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Sciences，Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China； 2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

Abstract:Oocyte maturation in fish involves numerous cell signaling cascades，including complex regulation by a set of endocrine/autocrine factors during specific stages of oocyte development.Wild largemouth bronze gudgeon（Coreius guichenoti）in the Yangtze River，which are group-synchronous reproducers，provide an opportunity to characterize the features associated with each emerging stage during the process of ovary development.This study reports the transcriptome profiling analysis of wild largemouth bronze gudgeon（Coreius guichenoti）ovaries at various morphologically diverse stages using the powerful RNA-seq approach.Our RNA-seq analysis identified 11495 contigs with definite gene description according to the zebrafish genome.Focusing on the endocrine/autocrine signaling pathways involved in oocyte maturation and ovulation，the expression profiles of the genes involved in the sensing cascade and metabolism pathways of various hormones and growth factors，such as prolactin（PRL），follicle-stimulating hormone（FSH），estrogen，prostaglandin E2（PGE2），growth/differentiation factor 9（GDF9），activin，and anti-Müllerian hormone（AMH），were analyzed.Our results indicate an overall conservation of the components and transcriptome alterations underlying oocyte maturation in fish and other vertebrate models.The transcriptional profile also suggests that 17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one and not 11-deoxycorticosteron may be synthesized as the maturation-inducing hormone in largemouth bronze gudgeon.The transcripts of the complete set of genes associated with the primary bile acid synthesis pathway in the fish ovary were also observed.This transcriptome profiling analysis provides valuable information regarding thousands of transcripts involved in the ovulation of wild largemouth bronze gudgeon.Because this fish is a wild group-synchronous spawner，the results obtained in our study also revealed insights into the cascades of endocrine regulatory events underlying fish oocyte maturation.

Key words:Coreius guichenoti； Ovarian maturation； Transcriptome analysis； Endocrine/autocrine signals

中图分类号：Q344+.1

文献标识码：A

文章编号：1000-3207（2016）03-0431-12

doi:10.7541/2016.58

收稿日期：2015-05-05；

修订日期：2015-07-23

基金项目：国家科技支撑计划基金项目（No.2012BAD25B08）； 三峡集团研究项目（CT-12-08-01）资助［Supported by the National Key Technology R&D Program of China（No.2012BAD25B08）； Research Project of China Three Gorges Corporation（CT-12-08-01）］

作者简介：夏雨果（1988—），女，湖北人； 博士研究生； 主要从事鱼类生态学和鱼类资源学研究。E-mail:xiayg@ihb.ac.cn

通信作者：殷战，zyin@ihb.ac.cn； 刘家寿，jsliu@ihb.ac.cn