筛选人睾丸特异性含溴结构域蛋白(BRDT)的小分子抑制剂

高娜娜，侯丽，周越，辛玲，杨朵，李娜，王慧萍*

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京　100038；2.国家卫生计生委科学技术研究所，北京　100081)

·技术与方法·

筛选人睾丸特异性含溴结构域蛋白(BRDT)的小分子抑制剂

高娜娜1，2，侯丽2，周越2，辛玲2，杨朵1，李娜1，王慧萍2*

(1.首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038；2.国家卫生计生委科学技术研究所，北京100081)

【摘要】目的睾丸特异性含溴结构域的蛋白(BRDT)在睾丸中特异表达，参与精子生成的染色质重组过程。本文虚拟筛选基于结构的人BRDT小分子抑制剂。方法从PDB(Protein Data Bank)下载BRDT核心结构域与小分子抑制剂JQ1结合结构域的晶体结构(PDB ID：4FLP)，利用分子模拟软件Discovery Studio 3.0，构建了其活性位点抑制剂的药效团模型。运用最佳药效团模型对10 000个化合物的数据库进行初筛，随后运用Libdock分子对接方式对初筛得到的潜在目标化合物进行复筛；最后运用BRDT Bromodomain TR-FRET Assay方法，对虚拟筛选得到的化合物进行实物筛选。结果运用虚拟筛选和蛋白水平筛选相结合的方法，从40 000个化合物中最终得到1个对BRDT有较高抑制作用的小分子抑制剂T480。结论利用一种基于结构的集合虚拟筛选与蛋白水平筛选的BRDT抑制剂的高通量筛选方法，筛选到BRDT的一个小分子抑制剂。

【关键词】睾丸特异性含溴结构域蛋白；男性抗生育；精子生成；虚拟筛选

Methods： The crystal structure (PDB ID：4FLP) of core domain of BRDT and binding domain of JQ1 were downloaded from PDB. In this study，the pharmacophor model of BRDT was established based on the three dimensional crystal structure of BRDT and JQ1 cocrystallization by Discovery Studio 3.0. Firstly，the optimal pharmacophore model was used to screen large compound database. Secondly，we used Libdock to screen the foregoing candidate compounds. Thirdly，We re-screened the candidate compounds using screening model at protein level. Finally，virtual screening of compounds was subjected to physical screening by BRDT Bromodomain TR-FRET Assay.

Results： Using virtual screening combined with protein level screening，a small molecular inhibitor target human BRDT (T480) was obtained from 40 000 compounds.

Conclusions： One positive compound target human BRDT is obtained through structure-based virtual screening combined with protein level screening.

(JReprodMed2016，25(6)：550-555)

男性抗生育药物研究已经有十几年的历史，已经有一些激素类和非激素类抗生育药物被发现[1-2]。这类药物一般是通过抑制精子的生成，降低精子的数量，阻断精子游动达到避孕的目的[3]。但目前除了进入临床研究的药物——睾酮类似物和gamendazole[4]之外尚无一种可以应用于临床的口服抗生育药物，因此开发男性抗生育药物具有深远的社会意义。

睾丸特异性含溴结构域的蛋白(testis-specific bromodomain-containing protein，BRDT)是bromodomain and extra-terminal(BET)BET蛋白家族的成员，它是一种包含947个氨基酸(180 kDa)的核蛋白。与BET蛋白家族其它成员最大的不同之处是，BRDT在睾丸中特异表达[5]。有报道认为，BRDT可能在脑组织和卵母细胞中有微量表达[6]，但尚未得到证实。BRDT包括两个溴结构域：BD1(26～121)和BD2(276～364)(图1)。有研究[7]发现，BRDT参与了睾丸中精子生成的染色质重组过程。在减数分裂之后，BRDT通过成对的乙酰基-赖氨酸识别模块使高度乙酰化的组蛋白重组[8]，该作用是其第一溴结构域(BD1，图1)介导的，BD1以中等效价(20 μm)[9]与组蛋白H4-4乙酰化氨基酸末端(H4Kac4)连接。通过对鼠科动物的BRDT蛋白结构研究发现，BD1通过保守的天冬氨酸残基与二乙酰基化的组蛋白4肽段(H4K5a c8ac)结合；将BRDT1编码区域选择性删除，足以使亚等位基因纯合子雄性小鼠不孕[10]。对不孕不育的男性全基因组分析表明BRDT的单核苷酸多态性与欧洲男子的少精子症和无精子症相关[10]。此外，Jones等[11]通过mRNA检测发现BRDT的表达只限于正常睾丸组织，并且在10例未经组织学定义的肺癌和8种不同器官的癌细胞系中也没有检测到BRDT，说明BRDT的表达具有非常严格的组织特异性。以上这些发现使BRDT成为男性抗生育药物研究的潜在靶标。本研究应用基于人BRDT抑制剂的集合虚拟筛选方法和体外蛋白水平筛选方法，筛选BRDT的小分子抑制剂，为男性抗生育药物研发寻找某些先导化合物。

图1　BRDT的结构域图解

图2　活性化合物JQ1的对映异构体[10]

材料与方法

一、试剂

BRDT Bromodomain TR-FRET Assay试剂盒购于Cayman化学公司(美国)。

二、分子对接软件及模块

软件：Discovery StudioTM3.0(accelrys公司)。分子对接模块：DS structure-based pharmacophore modeling；Receptor-Ligand Pharmacophore Generation module；DS Sequence Analysis；DS Protein Refine；DS Protein Health；DS LibDock。

三、实验方法

1. 人BRDT小分子抑制剂药效团模型的构建：目前PDB数据库里已经有人BRDT与JQ1 (图2)共结晶的三维晶体结构(PDB ID：4FLP)的报道，我们运用该结构进行药效团模型的生成。关于BRDT小分子抑制的报道很少，我们运用的是Discovery Studio 3.0 (Accelrys，San Diego，CA，USA)的“Receptor-Ligand Pharmacophore Generation module”药效团构建模块来构建药效团模型。以人BRDT与JQ1共结晶活性构象的三维立体结构作为输入文件，产生基于受体与配体结合的药效团模型。利用Discovery Studio 3.0对BRDT活性构象立体结

构进行加氢和加水分子的处理。将最小结构特征和最大结构特征的参数分别设置为4和6。亲脂性位点密度参数设为15，极性位点参数设为20。Receptor-Ligand Pharmacophore Generation模块可以根据乙酰-赖氨酸结合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式识别活性位点中所有可能和配体相互作用的作用位点。去除那些离PTP-loop及特异性深穴较远的作用位点，仅保留和关键性氨基酸残基相互作用的作用位点，然后依据和受体的相互作用模式对所有的作用位点进行聚类，最后得到可用于虚拟筛选的药效团模型。

2. 基于药效团模型的虚拟筛选：把最后构建好的药效团模型作为3D提问输入对大型化合物数据库进行高通量虚拟筛选，以期得到靶向BRDT活性位点的小分子抑制剂。仅保留那些匹配一半以上药效特征元素的化合物。这些化合物再次通过Lipinski’s rule of five进行过滤，以保障其具有类药性。

3.基于分子对接的虚拟筛选：所有的对接研究都是利用Libdock[12]进行对接的。在对接研究中，采用同样的BRDT的活性构象的三维结构。对接中采用的是Charmm力场。对接位点定义为一个以活性位点为中心的直径9Å的球形，这个球形足以覆盖BRDT与JQ1结合位点的关键氨基酸残基。为了选取打分函数和对接参数，本研究将JQ1对接到BRDT活性位点，以对接构象是否满足催化机制为依据进行打分函数的选择和参数优化。

4. 体外蛋白水平筛选模型的建立及优化：该实验的反应体系为20 μl。将阳性化合物JQ1用1×TR-FRET Assay buffer溶解至四倍的终浓度。筛选模型设置阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组是在反应体系中加入抑制剂JQ1。阴性对照组是以1×TR-FRET Assay buffer代替样品模拟无抑制作用。在实验开始之前将阳性对照孔和筛选样品孔在室温下孵育15 min，使阳性化合物与待测样品与BRDT bromodomainEuropium Chelate预平衡，最后加入5 μl BRDT bromodomain Ligand/APC Acceptor Mixture 引发反应。将板子用铝箔密封在室温孵育1 h，检测620 nm和670 nm发射光的数值。筛选模型检测体系如表1所示。

表1　筛选模型检测体系

该反应体系运用TR-FRET Ratio(670 nm emission/620 nm emission)来检测样品与BRDT蛋白亲和力。TR-FRET Ratio值越低，表明样品与BRDT蛋白的亲和力越强，反之则越弱。

结果

一、成功构建基于受体-配体药效团模型

利用Discovery Studio 3.0中的“受体-配体药效团模型”模块来构建药效团模型产生基于BRDT与JQ1复合物相互作用方式的药效团模型。首先移除水分子，添加氢键形成受体结构。将最小结构特征和最大结构特征的参数分别设置为4和6。随后Receptor-Ligand Pharmacophore Generation module模块会根据乙酰-赖氨酸结合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式识别所有可能的药效团模型。BRDT抑制剂的最终药效团模型(图3)，包含5个特征元素，1个氢键供体特征(HBD)，4个疏水作用结构特征和14个排除体积特征。

图4A中显示的是该药效团模型中起作用的氨基酸残基有保守氨基酸残基ASN109、ILE115、LEU61、PHE52、MET118、ASP114和药效团结构特征。图4B显示的是JQ1与药效团特征的匹配方式，从图中可以看出JQ1与药效团特征能够很好的匹配。图4C显示的是药效团模型同BRDT-JQ1复合晶体结构的匹配情况。从图中可以看出氢键受体对应于JQ1的三唑环以及BRDT活性中心的保守氨基酸残基Asn109之间形成的氢键连接，四个疏水结构特征分别与JQ1的不同部分匹配：H1、H2、H3和H4分别与JQ1的甲基，噻吩环，苯环和叔丁基相匹配。

该模型包括1个氢键受体(绿色表示)，4个疏水作用结构特征(蓝色表示)，14个excluded volume features(排除体积特征)(灰色表示)图3　BRDT抑制剂的最佳药效团模型

二、基于药效团模型的虚拟筛选

把构建好的药效团模型作为3D提问输入化合物数据库(4万个化合物)进行高通量虚拟筛选，以期得到靶向BRDT活性位点的小分子抑制剂。虚拟筛选中，仅保留那些匹配一半以上药效团特征元素的化合物，最后得到8 937个化合物用于后续的对接研究。

三、基于分子对接的虚拟筛选

所有分子对接研究都是利用Libdock[12]进行对接的。在对接研究中，采用同样的BRDT的活性构象的三维结构。运用Discovery studio3.0成功定义BRDT蛋白的活性位点(图5)，设置活性区域的直径为9.0Å，这个球形足以覆盖BRDT与JQ1结合位点的关键氨基酸残基。将JQ1与BRDT的活性口袋按照Libdock模块进行对接(图6)，得分值为118.924，以此分值作为确定阳性化合物的标准。随后将经药效团模型初筛得到的8 937个阳性化合物与BRDT的活性口袋按照Libdock对接方式进行虚拟对接，将对接结果按照从高到低排列，对接结果打分值高于118的化合物有350个。

A：药效团模型和起作用的氨基酸残基；B：药效团模型与JQ1的匹配结果；C：药效团模型同BRDT-JQ1晶体复合物的匹配结果。BRDT活性位点附近的氨基酸残基用棒状表示，绿色箭头表示氢键作用；药效团模型的药效特征元素颜色表示：绿色：氢键受体；蓝色：疏水特征，灰色：排除体积图4　药效团模型的结构特征分析

红色球表示BRDT的活性位点，红色条带表示BRDT蛋白链图5　BRDT的活性位点示意图

红色条带表示BRDT蛋白链，棒状结构为JQ1 图6　JQ1与BRDT的对接图

四、化合物蛋白水平筛选

用BRDT Bromodomain TR-FRET Assay方法，对经虚拟筛选得到350个阳性化合物进行蛋白水平的测定。该试剂盒运用JQ1作为阳性对照。首先我们摸索了反应的合适条件，得到了JQ1的量效关系曲线如图7所示。我们将在化合物浓度100 μmol/L时抑制率大于30%的定为阳性样品，经过3次重复筛选，得到1个对BRDT与乙酰赖氨酸的结合有抑制作用的化合物T480，图8显示了这个化合物的化学结构，其抑制率结果见表2。化合物T480属于唑类小分子化合物，我们将其命名为3-(4-氯苯基)-1-苯基吡唑-4-N-(1-苯基四氮唑)-5-甲基甲胺，可以通过购买得到。

图7　JQ1的量效关系曲线

图8　阳性化合物T480的化学结构

化合物样品号抑制率(%)虚拟对接分数IC50(μmol/L)T48065.53109.5189.020JQ170.34118.9240.133

讨论

睾丸特异性含溴结构域蛋白(BRDT)在精子发生过程的在核染色质重组中起关键作用，BRDT的第一个溴结构域BD1缺失导致圆形精子细胞错误伸长、精子形态严重缺陷，精母细胞和精子细胞缺乏全长的BRDT将会导致转录和可变剪接过程发生改变[13]。因此，BRDT是精子发生过程中所必需的。此外，BRDT蛋白只在睾丸细胞中特异表达，在有丝分裂生成的精原细胞中不存在，这样BRDT特异性抑制剂不会影响精子发生的干细胞的数量，理论上说可以使精子发生具有可逆性[14]。基于BRDT在精子发生过程中的关键作用，及其不同寻常的高度组织特异性，使其有可能成为发展新型男性抗生育药物的潜在靶点。

本研究集合计算机虚拟筛选水平和BRDT体外蛋白水平抑制作用测定，进行男性抗生育药物的理性化筛选，大大提高了筛选效率，节约了筛选成本。计算机药物虚拟筛选技术是20 世纪后期发展起来的新药发现新技术，近年来引起了研究机构和制药公司的高度重视[15-16]，并且已经成为一种与高通量筛选互补的实用化工具，加入到了创新药物研究的工作流程(pipeline)中。它的介入改变了药物筛选的模式，从原先的“体外(in vitro)筛选→体内(in vivo)筛选”变为“虚拟(in silico)筛选→体外(in vitro)筛选→体内(in vivo)”，与传统高通量筛选相比，它具有高效、快速、经济等优势[17]。人BRDT的三维晶体结构于2013年已经报道，为本研究开展虚拟筛选提供良好的契机。本研究利用计算机虚拟筛选技术在短时间内对约4万个化合物进行了筛选，并进行了蛋白水平活性验证，得到了对人BRDT有潜在抑制作用的小分子抑制剂，这样大大缩小了化合物的筛选范围，提高了筛选效率，不足之处是可能会漏筛掉很多好的化合物，但是这种方法对庞大的化合物数据库还是比较可行的。

本研究筛选到1个阳性化合物T480，结构较为新颖，可以购买得到，为我们进一步开发新的BRDT抑制剂提供借鉴作用；但该化合物的毒性及对精子发生的抑制活性还需要进行动物体内活性验证。

综上所述，本研究通过Discovery studio 3.0软件，建立起靶向人BRDT的药效团模型和Libdock分子对接虚拟筛选模型，运用其对大规模化合物数据库进行筛选；随后，运用蛋白水平筛选模型对虚拟筛选得到的阳性化合物进行复筛，最终得到了1个人BRDT的小分子抑制剂。本研究所采用的分层次多步骤理性化筛选策略，可以扬长避短，显著缩短药物筛选的时间，大大提高药物发现的几率。

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[编辑：郭永]

Discovery of male anti-fertility inhibitors target BRDT through structure-based virtual screening

GAO Na-na1，2，HOU Li2，ZHOU Yue2，XIN Ling2，YANG Duo1，LI Na1，WANG Hui-ping2*

1.CentralLaboratory，BeijingShijitanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity，Beijing1000382.DepartmentofReproductiveImmunology，NationalResearchInstituteforFamilyPlanning，Beijing100081

【Abstract】Objective： To structure-based virtual screen the inhibitors of human testis-specific and bromodomain containing protein (BRDT).

Key words：Testis-specific bromodomain-containing protein (BRDT)；Male antifertility；Spermatogenesis；Virtual screening

DOI：10.3969/j.issn.1004-3845.2016.06.012

【收稿日期】2016-02-19；【修回日期】2016-03-16

【基金项目】中央级公益科研院所基本科研业务费专项(2012GJSSJKB01)；中国博士后科学基金(2014M550678)

【作者简介】高娜娜，女，山东潍坊人，博士，男性抗生育药物筛选专业.(*通讯作者)