柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠钠通道稳态失活及再恢复的影响*

盛望　刘侃　王瑾茜　袁华　刘建和△（.湖南中医药大学第一附属医院，湖南　长沙　40007；.湖南中医药大学，湖南　长沙　4008）



柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠钠通道稳态失活及再恢复的影响*

盛望1刘侃2王瑾茜2袁华1刘建和1△
（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2.湖南中医药大学，湖南长沙410208）

【摘要】目的观察柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠心室肌细胞膜钠通道电流及钠通道稳态失活及再恢复的影响，寻求该药治疗心律失常的分子细胞学机制。方法将所有大鼠随机分为假手术组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组、胺碘酮组各10只，建立缺血性心律失常动物模型，酶解法分离心室肌细胞，采用全细胞膜片钳技术记录各组钠通道电流（INa）的变化。结果各组细胞I～V曲线均在-70 mV时激活，-20 mV时出现峰值，+40 mV出现反转，组间比较，以胺碘酮组和中药高剂量组I～V曲线较低；各组INa峰值比较，中药高剂量组和胺碘酮组均较模型组明显下降（P＜0.01），两组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中药高剂量组和胺碘酮组INa稳态失活曲线较模型组有明显左移趋势；各组INa半数失活电压V0.5比较，中药高剂量组和胺碘酮组较模型组明显降低（P＜0.01），两组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。中药高剂量组和胺碘酮组INa灭活后再恢复曲线较模型组有明显下移趋势；各组在时间间隔为45、95、145 ms时INa恢复程度比较，中药高剂量组和胺碘酮组较模型组明显降低（P＜0.01），两组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论柴胡三参胶囊能够结合钠通道失活态并对其产生抑制作用，延缓钠通道失活后再恢复，这可能是其抗心律失常的机制之一。

【关键词】缺血性心律失常柴胡三参胶囊钠通道膜片钳

心律失常是常见心血管疾病之一，各种类型的心律失常，尤其室性心动过速、心房颤动等恶性心律失常，不但可加重原有心脏疾患，还可诱发心源性猝死［1］。当前临床对本病治疗主要以口服药物为主，但各类抗心律失常药物均有导致心律失常的风险，甚至增加患者死亡率；而介入治疗或者射频消融等外科治疗方式创伤大且价格昂贵，难以切合患者实际需求［2］。因此，寻求一种针对本病、副作用少、经济有效的治疗药物具有重要的医学及社会意义。研究显示，中医药治疗心律失常具有疗效确切、效果稳定、不良反应较少等优势，有望为本病治疗开辟新的途径。前期研究证明，柴胡三参胶囊可通过Ca2+拮抗等机制产生对心律失常大鼠模型的保护作用，且无明显毒副作用［3-4］。本研究拟通过酶消化法分离大鼠左心室肌细胞，采用膜片钳技术，观察柴胡三参胶囊对缺血性心律失常大鼠心室肌细胞膜钠通道电流（INa）、通道稳态失活及再恢复的影响，寻求该药治疗心律失常的分子细胞学机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物成年Wistar大鼠50只，雌雄不拘，SPF级，体质量150～200 g，由湖南中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号:4304700472。动物饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，许可证号: SYXK（湘）2009-0001。

1.2药物与试剂柴胡三参胶囊，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科制备，规格:0.4 g/片，批号: 681210；盐酸胺碘酮片，规格:200mg/片，杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司生产，批号:国药准字H19993254。无钙台氏液（mmol/L）:NaCl 140、NaHCO311.9、KCl 25.4、MgCl20.53、NaHPO40.33、HEPES 5.0、Glucose 10，NaOH调pH为7.3；酶液:无钙台氏液中加入Ⅰ型胶原酶至0.4 g/L、牛血清白蛋白至2 g/L；KB液（mmol/L）:KOH 70、KCl 40、KH2PO420、L -glutamic acid 50、Taurine 20、EGTA 0.5、HEPES 10、Glucose 10，KOH调pH为7.3；INa细胞内液（mmol/L）:CsCl 130、MgCl22、NaCl 10、HEPES 10，CsOH调pH为7.3；INa细胞外液（mmol/L）:氯化胆碱100、NaCl 150、MgCl22、HEPES 10、Glucose 10，NaOH调pH为7.3，加入4-AP 5、CsCl 20阻断K+电流，加入CdCl20.3阻断Ca2+电流。

1.3主要仪器倒置显微镜（日本Olympus公司），膜片钳信号放大器及记录分析软件pulse+pulsefit 8.53（德国HEKA公司），多导生理信号采集系统（成都仪器厂），小动物人工呼吸机（浙江医科大学医疗仪器厂），微电极拉丝仪（美国Sutter公司）。

1.4分组及造模所有大鼠随机分为假手术组、模型组、中药低剂量组、中药高剂量组、胺碘酮组，共5组，每组10只，参考文献［5］采用结扎冠状动脉左前降支的方法建立缺血性心律失常动物模型。大鼠适应性喂养1周后，予10%水合氯醛麻醉、固定、连接四道生理记录仪及小动物呼吸机；左侧胸部胸部备皮、消毒，手术剪由左侧胸骨下端向左腋方向剪开胸腔、分离胸膜、暴露心脏，显微持针器用6.0缝合线结扎冠状动脉左前降支（假手术组只穿线不结扎）；观察心电图，出现ST段或者T波抬高、心脏局部颜色变暗等变化说明动物模型复制成功。

1.5给药方法造模后3 d开始灌胃给药，中药组成:柴胡15 g，法半夏9 g，苦参15 g，丹参15 g，党参20 g，黄连6 g，青蒿10 g，炙甘草5 g。中药按成人等效剂量4.8 g/d换算，低剂量组灌胃2.4 g/d，高剂量组灌胃9.6 g/d；胺碘酮组予灌胃胺碘酮0.1 g/（kg·d），其余各组均灌胃0.9%NaCl，各组灌胃体积均为10 mL/kg。1个月后取材分离心肌细胞。

1.6标本采集与检测1）心室肌细胞的分离:取大鼠，开胸取心脏，剪去心包，从主动脉根部连接心脏灌流装置，用37度无钙台氏液灌流6～8 min；换用配制好的酶液反复灌流8～10 min，直至心脏膨大、松弛并出现拉丝后取下；取心室壁组织、剪碎，置于酶液与台式液1∶1混合液中，搅拌并充入O2，4～5 min后吸取上清于KB液中，静置1 h镜下观察细胞膜恢复即可。2）膜片钳全细胞记录:微电极拉丝仪将清洁毛坯电极拉制成玻璃微电极，阻抗2～3 MΩ；采用Hamill［6］法，将心室肌细胞滴于灌流槽中，静置5 min后用INa细胞外液2～3 mL/min灌流以冲去细胞碎片；采用三维液压微操控器将电极靠近细胞、稍加负压可形成1 GΩ以上的高阻抗封接，再用较大负压吸破细胞膜形成全细胞记录，记录不同刺激下的相应电流。3）INa电流记录: （1）电流-电压曲线:保持电位（HP）=-140 mV、阶跃+10 mV、频率1 Hz、钳制50ms，给予从-80 mV至+60 mV去极化脉冲刺激；以电流幅值与膜电容之比（pA/pF）表示电流值（电流密度），将钳制电压和电流值连线绘图连线，即为INa密度-电压（I～V）曲线。（2）稳态失活曲线:双脉冲刺激法，HP=-120 mV，条件脉冲-160～-40 mV，钳制时间1000 ms，阶跃+10 mV；条件脉冲后加一去极化到-30 mV的测试脉冲，持续50 ms，将记录的INa与最大激活时INa比值，及对应脉冲膜电位连线作图即为INa失活曲线，采用Pulse +Pulsefit软件计算INa半数失活电压（V0.5）。（3）灭活后再恢复曲线双脉冲刺激法，第1个脉冲HP=-80 mV，去极化到-20 mV，持续50ms，在第1个脉冲回到HP后5 ms给予第2个脉冲，去极化到-30 mV，随后每间隔10 ms给予脉冲刺激直至145 ms，频率=1 Hz；以第2个脉冲与第1个脉冲比值及相应时间连线作图即为INa失活后再恢复曲线。

1.7统计学处理采用SPSS19.0统计学软件。计量资料以（）表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组心肌细胞INa密度-电压（I～V）曲线比较见表1，图1。各组心室肌细胞所监测的钠通道电流变化见图1，各组细胞I～V曲线均在-70 mV时激活，-20 mV时出现峰值，+40 mV出现反转，组间比较，以胺碘酮组和中药高剂量组I～V曲线较低；各组INa峰值比较，中药高剂量组和胺碘酮组均较模型组明显下降（P＜0.01），两组组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

图1　各组心肌细胞INa密度-电压（I～V）曲线比较

2.2各组INa稳态失活曲线的变化比较见图2，表1。中药高剂量组和胺碘酮组INa稳态失活曲线较模型组有明显左移趋势；各组INa半数失活电压V0.5比较，中药高剂量组和胺碘酮组较模型组明显降低（P＜0.01），两组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表1　各组I Na电流峰值及V0.5比较

表1　各组I Na电流峰值及V0.5比较

与模型组比较，△△P＜0.01。

组　别　n　INa电流峰值（pA/pF）　V0.5（mV）假手术组　10　-28.61±5.03　-97.17±7.13模型组　10　-25.88±4.65　-110.56±5.67中药低剂量组　10　-24.62±3.98　-112.12±6.12中药高剂量组　10　-20.11±2.67△△　-127.23±-4.15△△胺碘酮组　10　-18.51±2.32△△　-125.48±5.01△△

图2　各组心肌细胞INa稳态失活曲线比较

2.3各组INa灭活后再恢复曲线变化比较见图3。中药高剂量组和胺碘酮组INa灭活后再恢复曲线较模型组有明显下移趋势；各组在时间间隔为45、95、145 ms 时INa恢复程度比较，中药高剂量组和胺碘酮组较模型组明显降低（P＜0.01），两组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

图3　各组心肌细胞INa灭活后再恢复曲线比较

3　讨论

1976年德国学者Neher和Sakmann发明了膜片钳技术，能直接反应细胞膜上离子通道活动，膜片钳全细胞法可直接测定膜离子通道电流的大小，还可以研究通道的动力学及药物对通道动力学的影响［5］。Na+通道广泛存在于各类细胞中，是抗心律失常药物常见心肌细胞上效应靶点之一。Na+通道的激活是电压依赖的，当膜电位在-80～-90 mV时可发生去极化，通道被激活导致Na+快速内流，表现为动作电位上升相。Na+电流是快反应心肌细胞动作电位0期除极化主要成分，动作电位0位相的最大上升速度和幅度决定了冲动的传导速度，但这也与动作电位平台期内“钠窗电流”（慢钠通道的慢钠电流）有关。Na+通道的激活决定着心肌细胞的兴奋性和传导性，Na+通道电生理改变也是发生心律失常的重要机制之一［6］。

心律失常在中医学中属于“心悸”“怔忡”“惊悸”范畴，中医认为，“阴阳之气不能顺承，病则时发时已，可予小柴胡汤和解”［7］，阵发性疾病发作多与少阳相关；心律失常阵发性发作，类似于少阳证之寒热往来阵作，因痰湿瘀血等宿邪作祟，正胜邪退则脉率/律稳定，邪胜正退则内扰心神发为心悸。因此，本研究采用柴胡三参胶囊和解少阳，定悸养心，祛瘀化痰，益气通经。方中柴胡、青蒿芳香疏泄、和解少阳；法半夏、苦参燥湿化痰、祛邪散气；丹参活血祛瘀；黄连清心定悸；党参温补心脉；炙甘草调和诸药。全方共奏和解定悸、祛瘀化痰、益气通经之功。

本研究发现，柴胡三参胶囊高剂量组及胺碘酮组心肌细胞INa峰值、INa半数失活电压V0.5及INa I～V曲线均较缺血性心律失常模型组明显下降，表明高剂量柴胡三参胶囊和胺碘酮均能作用于INa，可降低其最大激活电压Vmax，延迟冲动传导时间；INa稳态失活曲线和灭活后恢复曲线可反映出通道的电压依赖特征和通道灭活后的恢复过程，常用来判断药物对通道失活态的影响［8］。本研究结果示，柴胡三参胶囊高剂量组及胺碘酮组INa稳态失活曲线较模型组有明显左移趋势，INa灭活后再恢复曲线较模型组有明显下移趋势，说明高剂量柴胡三参胶囊和胺碘酮均对失活态INa有较好的亲和力，能呈电压依赖地影响INa灭活过程，延缓INa失活后的恢复进程，延长心肌细胞动作电位时程，并降低0期电位的上升速率和幅度，总体有利于消除动作电位的传导折返，从而抑制快速性心律失常的发生，这也与其他学者关于胺碘酮的研究结果相一致［9］。

综上所述，柴胡三参胶囊能够结合INa失活态并对其产生抑制作用，延缓INa失活后再恢复，这可能是其抗心律失常的机制之一。

参考文献

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［4］刘建和，何少平，胡熙苒，等.柴胡三参胶囊对心肌缺血心律失常模型大鼠心肌细胞Ca（2+）及SERCA2a mRNA表达的影响［J］.中华中医药杂志，2010，10（25）:1574-1576.

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［6］van Hoeijen DA，Blom MT，Tan HL.Cardiac sodium channels and inherited electrophysiological disorders: an update on the pharmacotherapy［J］.Expert Opin Pharmacother，2014，15 （13）:1875-1887.

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·文献分析·

·研究报告·

Effects of Chaihu Sanshen Jiaonang on Steady-state Inactivation and Recovery of Sodium Channel in Ischemic Arrhythmia Rats

SHENG Wang，LIU Kan，WANG Jinxi，et al.The First Hospital of Human Univer- sity of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China.

【Abstract】Objective: To observe the effects of Chaihu Sanshen Jiaonang on steady-state inactivation and recovery of sodium channel in ischemic arrhythmia rats，and seek for the molecular cytological mechanism of Chaihu Sanshen Capsule on ischemic arrhythmia.Methods: Rats were randomly divided into sham operation group，the model group，low dosage of TCM group，high dosage of TCM group and amiodarone group.The annimal models of ischemic arrhythmia were made；ventricular myocytes were isolated with enzymatic digestion，and the change of sodium channel currents were detected with Patch-clamp techniques.Results: Compared with the model group，peak value of INa，V0.5 and I-V curve of high dosage of TCM group and amiodarone group decreased obviously （P＜0.01）；steady-state inactivation curve moved left and recovery curve moved down observably in the two.Conclusion: Chaihu Sanshen Jiaonang can combine the inactivation state of sodium channel，and have a suppression effect on the channel，which may be the mechanism of Chaihu Sanshen Jiaonang on ischemic arrhythmia.

【Key words】Ischemic arrhythmia；Chaihu Sanshen Jiaonang；Solium channel；Patch-clamp technique

中图分类号:R285.5

文献标志码:A

文章编号:1004-745X（2016）01-0042-04

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.015

*基金项目：湖南省教育厅项目（15C1048）

通信作者△（电子邮箱：ljhtcm@163.com）

收稿日期（2015-08-12）