喷气燃料中污染微生物检测方法概况

杨　浩，　熊　云*，　朱　鹏，　和倩倩，　黄海龙

1. 中国人民解放军后勤工程学院, 军事油料应用与管理工程系， 重庆 401331；2. 浙江省宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室, 宁波 315211

喷气燃料中污染微生物检测方法概况

杨浩1，熊云1*，朱鹏2，和倩倩1，黄海龙2

1. 中国人民解放军后勤工程学院, 军事油料应用与管理工程系， 重庆 401331；2. 浙江省宁波大学应用海洋生物技术教育部重点实验室, 宁波 315211

摘要：微生物污染不仅降解喷气燃料，还严重威胁储存和飞行安全。喷气燃料中污染微生物的检测是有效治理微生物污染的前提。基于此，本文将喷气燃料中污染微生物检测方法分为传统法、分析生物学法以及分子生物学方法，并对三种方法优缺点进行了详细介绍。最后对喷气燃料中污染微生物检测方法进行了展望。

关键词：喷气燃料； 微生物； 检测方法； 传统法； 分析生物学法； 分子生物学法

油库日常管理中基本上是不可能做到贮藏设备的绝对光洁以及无水，因此基本上无法避免喷气燃料中微生物的存在[1]。最早发现喷气燃料微生物污染是在上世纪50年代，Bakanauskas发现飞机油箱中有微生物的存在，并影响了飞机正常飞行。两年后，美国一架B-52轰炸机就因为微生物污染阻塞了过滤器而坠毁[2]。Gaylarde CC等发现喷气燃料中微生物的存在会腐蚀贮藏设备、管道、氧化密封项圈，也会堵塞飞机过滤器等等[3]。根据美国1991年调查报道，每年仅由硫酸盐还原菌造成的损失就有60亿美元之多[4]。鉴于此，喷气燃料微生物污染问题得到了广泛的关注，并提出了许多解决方法。但是，喷气燃料中污染微生物群落的鉴定是解决喷气燃料微生物污染问题前提，对针对性解决贮藏设备腐蚀、油料管道堵塞等问题具有重要的指导意义。喷气燃料中污染微生物的检测方法也是随着微生物检测技术的发展而不断改进，可分为传统学方法、分析微生物学方法以及分子生物学方法。本文便从这三个方面对喷气燃料中污染真菌检测方法概况进行介绍，并对各方法的优缺点进行了总结。

1传统方法

1.1传统方法应用

传统方法多是先将微生物进行培养基分离培养，再根据微生物形态学或者生态学特征、培养基理化变化以及特定的有性型分析来进行微生物种类鉴定。Darby RT等利用培养基方法对喷气燃料中微生物进行分离鉴定，最后得到了主要污染真菌为枝孢霉(Hormoconisresinae)、拟青霉(Paecilomycesvarioti)、青霉(Penicillium)以及曲霉(Aspergillus)。Ferrari等利用培养基方法从JP-4样品中分离出众多种类的微生物，并总结出主要污染真菌为枝孢霉(Hormoconisresinae)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、气单胞菌属(Aeromonas)以及硫酸盐还原菌(Sulfate Reducing Bacteria)[5]。郭玲玲等利用不同的培养基从喷气燃料微生物进行分离鉴定出了法式柠檬酸杆菌(Frenchcitricacidbacillus)、棒状杆菌(corynebacterium)、麦芽杆菌(Maltbacillus)以及葡萄球菌(Staphylococci)等细菌，青霉菌(Penicillium)、木霉菌(Trichoderma)、曲霉菌(Aspergillus)和枝孢霉菌(Hormoconisresinae)等真菌[6]。袁祥波等利用传统方法从喷气燃料悬浮物中分离鉴定出枝孢霉菌，从而验证了真菌是产生喷气燃料悬浮物的主要原因之一[7]。

1.2传统方法的局限性

传统方法具有成本低、方便简单的优点，方法成熟，适用性范围广，是不可或缺的微生物鉴定方法。但是传统方法基本上是建立在培养基基础上的，这就要求被鉴定的微生物能够在培养基中存活。但是Amann RI等发现自然环境中大约只有1%的微生物可以通过培养基的方法分离鉴定出来，表1列举出了不同生境下可培养微生物的比例。另外，建立在培养基方法上的传统方法因为需要对微生物进行培养，所以耗时长，难以满足快速检验的需求[8]。

表1　不用生境下可培养微生物比例

2分析生物学方法

鉴于传统方法的局限性，分析生物学法应运而生。这种方法主要是利用高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱法(MS)以及气质联用的方法(GC/MS)来分析检测微生物代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质 、多肽、多糖等，来进行微生物鉴定[9-11]。Fang J等利用GC/MS方法，通过对磷脂酯结合态脂肪酸分析，发现喷气燃料中大量硫酸盐还原菌的存在[12]。Jung等利用GC/MS检测藤黄类诺卡菌代谢产物，来比较藤黄类诺卡菌代谢不同长度碳链烃的能力[13]。Rauch ME等利用气相色谱法，通过分析脂肪酸甲酯鉴定出喷气燃料中九个属细菌，17种菌[14]。

分析生物学方法，实际上是借助化学分析的方法来进行微生物检测，相对于传统方法不需要对微生物进行培养，更加简单、而且耗时短。另外，可以在几个小时内快速定性或定量检测出纳克级别的微生物成分，所以可以用来快速鉴定微生物。但是，这种方法相比较来讲，需要专门的操作人员，并且还需要配备相应的仪器，成本很高。并且分析生物学方法鉴定结果受微生物自身以及环境有关。不同的温度、环境、微生物自身的胞龄都会或多或少的影响细胞脂肪酸的组成。即使严格按照仪器操作要求进行操作，数据库中含有未知菌种与否会直接影响分析微生物脂肪酸结果的准确性。尤其当数据库囊括的菌种匮乏的话，这种差异性会更大[15]。

3分子生物学方法

分子生物学方法是基于分子水平来研究生物生命活动及其科学规律，在微生物鉴定领域主要研究对象为微生物DNA和RNA。由于其具有准确性、灵敏度高、耗时短、特异性强、操作简单等优点，被广泛利用在微生物检测上[16]。在喷气燃料微生物检测方面的应用主要有聚合酶链式反应(PCR)方法，以及建立在PCR基础上的16S、18S rDNA以及ITS基因测序方法。另外环介导等温扩增技术(LAMP)和横向流动试纸条快速检测技术(LFD)相结合的LAMP-LFD检测方法也出现在喷气燃料微生物检测领域[17-21]。

3.1PCR以及建立在PCR基础上的检测技术

Denaro T等利用传统PCR和直接PCR方法在J-8样品中分离鉴定出了之前没有发现的28种菌，并且对比了直接PCR和传统PCR在鉴别微生物方面的差异，发现直接PCR不需要对微生物进行培养，大大减少了操作步骤以及检测周期，而且直接PCR检测出微生物的数量一般是传统PCR方法的4倍[17]。White等利用传统PCR以及建立在PCR基础上的变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法对30个样品进行微生物种群的鉴定分析，发现海洋杆菌属(Marinobacter)、伯克氏菌属(Burkholderia)以及盐单胞菌属(Halomonas)为主要的微生物种群[18]。Tardy-Jacquenod 等利用16S rDNA测序技术从水相样品中分离鉴定出了21种硫酸盐还原菌(Sulphate-reducing bacteria)[19]。袁祥波等利用18S rRNA技术特异性检测喷气燃料悬浮物中枝胞霉菌(Hormoconisresinae)，揭示了喷气燃料悬浮物和真菌生长之间的关系[7]。基于PCR基础上的16S、18S rRNA以及ITS测序相比较传统方法以及分析生物技术具有特异性更强、更准确，尤其在微生物多样性分析时具有更好的应用。

Rauch ME等对比GC-FAMEY法和16S方法鉴定喷气燃料中微生物，发现GC-FAMEY法分离鉴定出来的一种需氧型细菌为英美地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，但是DNA测序却发现该菌是短小芽孢杆菌Bacilluspumilus[15]。Harold W通过对比GC和16S rRNA方法发现，有些细菌GC方法没有检测出来，但是通过16S rRNA方法却检测出来[20]。这说明在菌种检测上，分子生物学方法特异性和准确性要强于分析生物学方法。另外基因测序可以突破传统方法的局限性，发现一些不能够分离培养的微生物，这对研究微生物多样性至关重要。

3.2LAMP方法的应用

LMAP是Notomi等人开发的一种新颖的恒温核酸扩增技术，相比于PCR技术具有特异性强、灵敏度该、操作简单、不依赖专业设备，耗时短等优点，近年来得到广泛应用[21]。LFD是Kiatpathomchai设计的一种可以将LAMP扩增结果短时间内呈现在试纸条上的一种技术,这就简化了LAMP产物检测步骤，缩短了检测时间，因此LAMP-LFD技术在微生物检测方面得到了越来越多的应用[22]。和倩倩等首次利用LAMP-LFD方法对喷气燃料中特征真菌枝孢霉(Hormoconisresinae)进行检测，并跟PCR方法进行对比，发现不论特异性还是灵敏度，LAMP-LFD都比PCR方法强。而且用时只需35 min，远远低于PCR的3 h[23]。但是同样因为LAMP方法扩增效率高，多组实验同时进行，容易发生气溶胶污染，出现假阳性[22]。

微流控技术的出现可以完美解决掉假阳性问题，并且还可以实现了LAMP反应的高通量检测。微流控是一种精确控制和操控微尺度流体，尤其特指亚微米结构的技术。图1为博奥生物有限公司开发的晶芯®RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪及配套碟式芯片，拥有我国自主知识产权，而且在国际上也处于领先地位,。其碟式芯片实验体系只需要1.5 μL,而普通LAMP方法反应体系为25 μL，大大减少了试剂以及模板使用量，节约了成本。碟式芯片具有24个通道，每个通道都设立缓冲区域，这样就实现了多组实验平行进行，而不会产生假阳性[24]。Zhou QJ等便利用晶芯®RTisochipTM-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪特异性检测出10种水产生物致病菌。并且发现和传统方法及PCR方法相比具有更高的灵敏度、特异性，而且操作简单、耗时更短以及反应体系小的优势，可以用在微生物实时监测上[25]。同时这些优点正是部队油库喷气燃料微生物检测所需要的，因此完全可以将这种技术运用在喷气燃料微生物检测上。

图1晶芯®RTisochipTM-A 恒温扩增微流控芯片

核酸分析仪及配套碟式芯片

4国际航空运输协会推荐的方法

国际航空运输协会推荐了四种检测飞机油箱中微生物的方法，为目前国际上运用最多的喷气燃料污染微生物检测方法[26]。根据原理可分为两大类，传统方法以及分子生物学方法。

4.1MicrobMonitor2®检测方法

英国ECHA微生物学有限公司开发的Microb-Monitor2®装置[26]，利用传统方法，原理为在半固体营养培养基中加入显色剂四氮唑红(TTC)，若检测燃料或水中含有微生物则在凝胶上会出现红色的菌落，根据培养基上培养的微生物数量，可定量检测燃料和水相中所有酵母菌、霉菌和细菌，如图2。

图2　使用MicrobMonitor2检测喷气燃料

4.2Easicult Combi检测方法

芬兰奥林诊断公司开发的Easicult Combi装置，这种装置只能检测水相中的微生物，原理上和 MicrobMonitor2方法相似，都是利用传统方法进行喷气燃料中污染微生物的检测，可做到半定量检测霉菌、酵母菌和细菌[26]。和第一种方法不同的是Easicult Combi有标准微生物培养生长图，鉴定时只需要将载片与标准图对比即可，如图3。

图3　使用Easicult Combi检测步骤

4.3HY-LiTE®JET A1燃料试验

HY-LiTE®JET A1燃料试验是德国默克集团开发出来的，利用分子生物学方法进行喷气燃料中污染微生物的检测，原理是通过测量样品中ATP的含量来评估样品中的活菌数，简便快捷操作简单[26]。Geva J等分别从22个军用油相中提取样品，分别利用测ATP荧光法和传统法检测燃料中微生物的量，发现燃料中菌落数在2 000 cfu/L～20 000 cfu/L之间时相关性达到0.96，而菌落数大于20 000 cfu/L时相关性变为0.54，菌落数小于2 000 cfu/L，相关性会更低，减小为0.25。所以，ATP荧光法用来评估喷气燃料中微生物数量具有局限性，但是当菌落数在2 000 cfu/L～20 000 cfu/L之间时，准确率还是很高的[27]。但是HY-LiTE®JET A1燃料试验即ATP荧光法只能告诉我们喷气燃料中是否有微生物的存在，以及微生物的数量(这种方法根据Geva J等研究发现，不一定准确)，但是无法告诉我们是哪些微生物，即无法对污染微生物进行特异性检测。

4.4FUELSTATTM resinae PLUS检测方法

FUELSTATTM resinae PLUS方法[26]便解决了HY-LiTE®JET A1方法不能对喷气燃料中微生物特异性检测的缺点，这种方法本质上就是酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术，特异性强，准确率高的优点。Gaylarde 等用酶联免疫吸附法来鉴定航空煤油中的枝孢霉菌，发现这种方法准确性高，很少会和其他真菌有交叉反应[28]。但是这种方法容易出现假阳性反应、酶标板整体背景高以及吸光度数值偏高或偏低等问题，并且造成这些问题的原因很多，而且这种方法比较适合实验室操作，很难应用在户外使用[29]。

5展望

传统方法，分析生物学方法以及分子生物学方法在实际运用中各有利弊，没有一种方法可以适用于所有环境，满足所有要求，应当根据实际需要选择不同的方法进行污染微生物的鉴定，并且有些时候为了准确，会运用两种或者三种方法进行比对以达到消除误差的效果。油库实地检测要求检测方法简单、特异性强、耗时短，抗干扰能力强等，而和倩倩等人针对部队实际需要开发的LAMP-LFD方法相对于传统方法、分析生物学方法以及其他分子生物学方法相比，特异性更强、耗时更短，而且不需要依赖相对昂贵的专业仪器，因此利于现场实地快速检测，值得推广[23]。尤其是微流控技术的成熟应用，使得LAMP方法高通量特异性检测喷气燃料中污染微生物得以实现。另外，根据LFD试纸条检测线亮度和LAMP扩增产物量之间的关系，可以发展LFD试纸条定量技术，这将是推动LAMP-LFD方法应用的另一个重要因素。假如LFD试纸条定量技术能够成熟运用，将使得油库喷气燃料污染微生物实地定性定量快速检测得以实现。

油罐中相对稳定的微环境的形成，必然经历了几次微生物群落演替。因此建立准确微生物群落演替数据库，对喷气燃料污染微生物的防治具有重要意义。这样当我们监测到某种或者某几种微生物出现的时候，根据微生物群落演替数据库，我们就可以模拟出油罐中微生物接下来的变化，这就对我们针对性解决微生物污染提供了基础。传统方法以及分析生物学方法由于其本身的局限性，所以并不适合微生物群落演替的研究，而PCR、16S rRNA以及18S rDNA等方法不仅耗时长，操作复杂，而且分辨率低，在分析亲缘关系近、变异小的物种时，会将多个邻近基因型的样本混为一体。新一代高通量测序技术(next-generation sequencing technology)的出现，大大缩短了测序时间，同时降低了成本，跨越了传统分子生物学研究方法所不能逾越的鸿沟，使得对所有目标样本进行全基因组测序和差异比较分析成为可能[30]。本课题组已经率先开展了此项工作，得到了一些进展，发现了之前许多喷气燃料微生物研究未曾出现的微生物，并对喷气燃料中微生物进行了归属。因此可以预见，新一代高通量测序技术(next-generation sequencing technology)在喷气燃料微生物污染问题的解决上具有广泛的应用前景。

参考文献

[1]Cui Y, Chen S. The key influence factors of microorganism pollution in jet fuel system[C]// Biomedical Engineering and Informatics (BMEI), 2011 4th International Conference on. IEEE, 2011:1541-1544.

[2]Finefrock VH, London SA. Microbial Contamination of USAF JP-4 Fuels,Technical Report AFAPL-TR-66-91 Aerospace Medical Research Laboratories.1966.

[3]Gaylarde CC, Bento FM, Kelley J. Microbial Contamination of Stored Hydrocarbon Fuels and Its Control[J]. Revista de Microbiologia, 1999,30(1):01-10.

[4]Badawi AM, Hegazy MA, El-Sawy AA,etal. Novel quaternary ammonium hydroxide cationic surfactants as corrosion inhibitors for carbon steel and as biocides for sulfate reducing bacteria (SRB)[J]. Materials Chemistry and Physics, 2010, 124(1): 458-465.

[5]Ferrari MD, Neirotti E, Albornoz C. Occurrence of heterotrophic bacteria and fungi in an aviation fuel handling system and its relationship with fuel fouling[J]. Revista Argentina De Microbiologia, 1998, 30(3):105-114.

[6]郭玲玲, 陈国需, 杨致邦等. 喷气燃料中微生物的分离和鉴定[J]. 后勤工程学院学报, 2008, 24(2):67-70

[7]袁祥波, 胡启文, 熊云等. 储存喷气燃料中特征真菌的鉴定与生长特性[J]. 后勤工程学院学报, 2014, 30(1): 59-63.

[8]Amann RI, Ludwig W, Schleifer KH. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.[J]. Microbiological Reviews, 1995, 59(1):143-169.

[9]康琳, 李楠, 高宏伟等. 质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用[J]. 中国卫生检验杂志, 2010, (10):2613-2615.

[10]周明奎,李文哲,朱文斯.变性高效液相色谱在微生物基因检测中的应用研究进展[J].生命科学研究,2006,10(2)SI:76-79.

[11]Gharaibeh AA, Voorhees KJ. Characterization of lipid fatty acids in whole-cell microorganisms using in situ supercritical fluid derivatization/extraction and gas chromatography/mass spectrometry.[J]. Analytical Chemistry, 1996, 68(17):2805-2810.

[12]Fang J, Barcelona MJ. Biogeochemical evidence for microbial community change in a jet fuel hydrocarbons-contaminated aquifer[J]. Organic Geochemistry, 1998, 29(4):899-907.

[13]Jung CM, Broberg C, Giuliani J,etal. Characterization of JP-7 jet fuel degradation by the bacteriumNocardioidesluteusstrain BAFB.[J]. Journal of Basic Microbiology, 2002, 42(2):127-131

[14]Rauch ME, Graef HW, Rozenzhak SM,etal. Characterization of microbial contamination in United States Air Force aviation fuel tanks[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2006, 33(1): 29-36.

[15]Janda JM, Abbott SL. Bacterial identification for publication: When is enough enough?[J]. Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40(6):1887-1891.

[16]刘晓鹏, 尚丹. 常用分子生物学技术在食品病原微生物检测中的应用[J]. 河北医药, 2015, 37(9):1391-1393.

[17]Denaro TR, Chelgren SK, Lang JN,etal. DNA Isolation of Microbial Contaminants in Aviation Turbine Fuel via Traditional Polymerase Chain Reaction (PCR) and Direct PCR. Preliminary Results[D]. Air Force Materiel Command, Air Force Research Laboratory, 2005.

[18]White J, Gilbert JA, Hill G,etal. Culture-independent analysis of bacterial fuel contamination provides insight into the level of concordance with the standard industry practice of aerobic cultivation.[J]. Applied & Environmental Microbiology, 2011, 77(13):4527-4538..

[19]Tardy-Jacquenod C, Caumette P, Matheron R,etal. Characterization of sulfate-reducing bacteria isolated from oil-field waters.[J]. Canadian Journal of Microbiology, 1996, 42(3):259-266.

[20]Graef HW. An Analysis of Microbial Contamination in Military Aviation Fuel Systems[D]. Ohio,USA Harold Air Force Institute of Technology, 2003.

[21]李志强. LAMP技术在微生物检测中的应用[J]. 生命科学仪器, 2009, 07(8):7-10.

[22]Kiatpathomchai W, Jaroenram W, Arunrut N,etal. Shrimp Taura syndrome virus detection by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick[J]. Journal of Virological Methods, 2008, 153(2): 214-217.

[23]和倩倩，熊云，朱鹏等.一种检测储存喷气燃料中特征真菌的新方法—LAMP-LFD[J].工业微生物，2015,45(3):8-13.

[24]博奥生物技术有限公司 http://cn.capitalbio.com/cms，2015.

[25]Zhou QJ, Wang L, Chen J,etal. Development and evaluation of a real-time fluorogenic loop-mediated isothermal amplification assay integrated on a microfluidic disc chip (on-chip LAMP) for rapid and simultaneous detection of ten pathogenic bacteria in aquatic animals.[J]. Journal of Microbiological Methods, 2014, 104:26-35.

[26] IATA 飞机油箱中微生物污染指导材料，2011.

[27] Passman FJ. Microbial contamination and its control in fuels and fuel systems since 1980-a review[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2013, 81:88-104.

[28]Gaylarde CC. Advances in detection of microbiologically induced corrosion.[J]. International Biodeterioration, 1990, 26(1):11-22.

[29]石超, 吕长鑫, 冯叙桥等. 酶联免疫吸附技术在食品检测分析中的研究进展[J]. 食品安全质量检测学报, 2014, 5(10):3269-3275.

[30]秦楠, 栗东芳, 杨瑞馥. 高通量测序技术及其在微生物学研究中的应用[J]. 微生物学报, 2011, 51(4):445-457.

An outline of detection methods for microorganisms in jet fuel

YANG Hao1, XIONG Yun1, ZHU Peng2, HE Qian-qian1,HUANG Hai-long2

1. Dept. of Oil Application & Management Engineering，LEU，Chongqing 401311，China;2. Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China

AbstractMicrobial contaminants in aviation fuel not only degrade the fuel, but also accelerate corrosion within the fuel tank and threaten flight safety. The detection of contaminating microorganism in jet fuel is the premise of effective treatment of microbial contamination. The methods for detecting the contamination in jet fuel are divided into traditional methods, analytical microbiology methods and molecular biology methods. The advantages and disadvantages of the three methods for detecting microrganisms in jet fuel and their developments were introduced.

Key wordsjet fuel; microorganism; detection methods; traditional methods; analytical microbiology methods; molecular biology methods

基金项目：总后勤部物资油料部重大项目“微生物对库存喷气燃料悬浮物的影响及防治技术研究” yx214L048。

作者简介：杨浩(1991～)，研究生， 主要从事方向为喷气燃料微生物污染方面的研究。E-mail：yanghaolyyz20@126.com。 *通讯作者: 熊云，教授，博士生导师。中国人民解放局后勤工程学院军用油料应用教研室主任,曾获部队科技进步二等奖，主要从事军用油品应用、油料节约研究。电话：023-8673142，E-mail：xyun241@126.com。