丁酸胁迫耦联丙酮丁醇梭菌-酿酒酵母混合培养强化丁醇发酵性能

何珍妮，　盖来兵，　罗洪镇，　张敬书，　赵艳丽，　段作营，　史仲平*

1.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122； 2.石家庄制药集团有限公司，河北 石家庄 050038；3.河北常山生化制药股份有限公司，河北 石家庄 050800

丁酸胁迫耦联丙酮丁醇梭菌-酿酒酵母混合培养强化丁醇发酵性能

何珍妮1，盖来兵2，罗洪镇1，张敬书2，赵艳丽3，段作营1，史仲平1*

1.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122； 2.石家庄制药集团有限公司，河北 石家庄 050038；3.河北常山生化制药股份有限公司，河北 石家庄 050800

摘要：为改善丁醇发酵性能，提出丁酸胁迫与丙酮丁醇梭菌-酿酒酵母混合培养体系协同作用的新型丁醇发酵优化控制策略。7 L发酵罐中，在溶剂生产期(24 h)添加4.0 g/L-broth的丁酸浓缩液和0.2 g-DCW/L-broth的酿酒酵母进行发酵，丁醇浓度、丁醇/丙酮比和总溶剂生产效率与对照相比分别提高35%、43%和79%，达到15.74 g/L、2.83和0.52 g/L/h的最高水平。若将精馏后溶剂混合物作为高效柴油添加剂，柴油添加剂中B∶A∶E比例可达74∶17∶9 (w/w)的高水平，产品质量获得显著改善。试验及分析阐明该优化控制策略可大幅诱发赖氨酸的分泌及在梭菌中的吸收/利用，提高梭菌对高丁醇浓度环境的耐受能力，促进丁醇合成；可强化梭菌对底物利用的竞争能力、提高电子往复穿梭传递系统中还原力再生速率、产生更多用于丁醇合成的NADH。两者的协同作用大幅提高了丁醇发酵的整体性能。

关键词：丁醇； 丙酮丁醇梭菌； 丁酸； 赖氨酸； NADH

丁醇是一种清洁高效的生物燃料，也是一种重要的平台化合物，广泛应用于生物能源和生物化工等领域。丁醇可用作柴油添加剂。随着油价上涨，利用发酵方法大规模生产丁醇日益引起研究者们的关注[1]。

丁醇发酵又称为丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵，发酵产物丁醇、丙酮和乙醇的质量比约为6∶3∶1[1,2]。作为添加剂使用时，提升ABE溶剂混合物中丁醇浓度可以提高ABE发酵产品的一次性回收率[3]。丁醇浓度、丁醇/丙酮比和总溶剂浓度是ABE发酵中三个重要指标。前期研究表明，添加少量丁酸虽然可以提高丁醇/丙酮比和总溶剂生产效率，但提升幅度很有限[4]。

研究数据显示，将产溶剂梭菌与纤维素分解菌[5]、枯草芽孢杆菌[6]等进行混合培养可一定程度上改善ABE发酵性能。酿酒酵母可在无氧条件下发酵生产乙醇，是工业上酒精生产的主要微生物[7]。在高温、有机酸、醇类物质等胁迫环境中，酿酒酵母自身有一套完备的应对机制[8]。因此理论上，通过混合培养梭菌和酿酒酵母来提高ABE的发酵性能是可行的。

本文探讨丙酮丁醇梭菌和酿酒酵母混合培养体系对ABE发酵性能的影响，并对该混合培养体系进行分析和优化，提出了丁酸环境胁迫与梭菌-酵母混合培养体系协同作用强化丁醇发酵性能的新型ABE发酵策略。

1材料与方法

1.1菌种

丙酮丁醇梭菌ATCC 824，实验室保藏。酿酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司。

1.2培养基及制备方法

梭菌活化培养基和发酵培养基的制备方法同前期报道[4]。酿酒酵母活化/发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母提取物8.5，(NH4)2SO41.3，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl2·2H2O 0.06。

1.3培养方法

1.3.1菌种活化方法

梭菌活化：将孢子液按10% (v/v)接种量转接到装有50 mL活化培养基的100 mL厌氧瓶中，沸水处理1 min，冰水浴处理1 min，在37 ℃水浴锅中培养27 h作为发酵种子。酿酒酵母活化：将酵母从斜面上接种到培养基中，于30 ℃、180 r/min摇床中培养24 h作为发酵种子。

1.3.2ABE发酵

100 mL厌氧瓶发酵：在厌氧条件下，将活化好的菌种按10% (v/v)转接到装有50 mL发酵玉米培养基(15%，w/v)的厌氧瓶中，在37 ℃水浴锅中培养。根据实验要求，添加一定量的丁酸或酿酒酵母。7 L罐发酵：接种前，向装有3.5 L玉米培养基(15%，w/v)的发酵罐通氮气30 min保证严格厌氧环境。接种后继续通氮气至罐内压强为0.04 MPa。发酵条件为37 ℃，初始pH 6.0，接种量10%(v/v)。添加丁酸和酿酒酵母：当发酵进入产溶剂期(24 h)，将丁酸浓缩液一次性接入发酵罐或厌氧瓶中，添加量为4.0 g/L-broth。酿酒酵母培养与ABE发酵同步，在装有2.7 L培养基的5 L发酵罐中按10%接种量进行培养(30 ℃、pH 6.0～6.2)。利用DO-Stat补料控制葡萄糖和乙醇浓度接近于0的水平。

1.4分析方法

发酵过程中的产气量、葡萄糖、游离氨基酸以及溶剂浓度的测定方法同前期报道[4]。酵母干重按DCW=OD600×0.22计算。气体测量方法：1 h内，前15 min利用2个装有6 mol/L NaOH的洗瓶除尽CO2，得到氢气释放量AH2。余下45 min测定总产气量AGAS。通过公式(1)计算CO2和H2的释放速率(rCO2和rH2)：

(1)

利用理想气体方程(105Pa，25 ℃)将AH2和AGAS转换为摩尔单位。用以时间为独立变量的多项式曲线拟合葡萄糖、乙醇和丙酮浓度，将其对时间求导得到rGLC，rEtOH和rACE。

2结果与讨论

2.1外添丁酸对提高ABE发酵性能、促进有益于丁醇合成氨基酸分泌的影响

丁酸是ABE发酵中重要的中间代谢物，丁酸的添加会影响梭菌的正常代谢[5]。如图1和表1所示，厌氧瓶中，外添丁酸(4.0 g/L)批次的丁醇浓度和丁醇/丙酮比分别达到15.29 g/L和2.70，比对照提高了19%和34%；罐发酵中，相应指标达到13.50 g/L和2.36。另外，外添丁酸量(4.0 g/L)高于发酵产酸期丁酸的积累浓度(1.0 g/L～2.0 g/L)。因此，外添丁酸对于梭菌生存而言是一种环境胁迫，有可能诱发梭菌产生某些物质、如氨基酸等以保护其生存。Heluane等[9]研究表明，赖氨酸和蛋氨酸对丁醇合成有正调节作用。此外，苯丙氨酸和酪氨酸对梭菌生长及丁醇合成均有促进作用，添加少量上述氨基酸可将丁醇浓度从12.0 g/L提高至14.2 g/L，生物量由3.44 g/L提高至4.57 g/L[10]。赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸有利于ABE发酵。

●丁醇；▲丙酮；■乙醇；○丁酸；△葡萄糖

图2A-2B是罐发酵条件下，有益于梭菌生存和丁醇合成的氨基酸的分泌积累情况。添加丁酸的发

酵批次(#b)中，上述氨基酸(赖氨酸除外)逐渐分泌积累，浓度不断增加。而对照(#a)中上述氨基酸浓度基本不变。外添丁酸可诱发苯丙氨酸、酪氨酸和蛋氨酸在梭菌胞内积累，并导致相应氨基酸的胞外分泌，一定程度上增强了梭菌对高丁醇浓度环境的耐受和产丁醇能力，但外添丁酸对提升发酵性能贡献有限，因此需要更有效的发酵策略以进一步提升ABE发酵的整体性能。

表1　不同操作模式下ABE发酵性能

(A)传统发酵，批次#a；(B)丁酸添加，批次#b；

图27 L发酵罐不同操作模式下的氨基酸分泌

2.2梭菌-酵母混合培养对ABE发酵性能的影响

酿酒酵母在高温、有机酸、醇类物质等胁迫环境下可分泌氨基酸等物质以抵御不利生存的恶劣环境。丁醇存在条件下酵母细胞翻译过程受抑制，胞内“氨基酸池”处于保护状态[11]，该环境可能导致酵母胞内氨基酸池中的氨基酸分泌到胞外，进而被梭菌细胞吸收利用。如图3所示，当酿酒酵母处于丁醇、丁酸和丁醇+丁酸环境胁迫下时，体系中有益于丁醇合成的氨基酸分泌量均大幅提高。因此，梭菌与酿酒酵母混合培养体系有提高ABE发酵性能的潜力。

图337 ℃及外部环境胁迫下酵母分泌氨基酸情况

在100 mL厌氧瓶中对混菌培养条件进行优化，确定最优条件为：37 ℃，发酵24 h时接入酵母，接入量0.2 g-DCW/L-broth。根据上述条件在7 L罐中进行梭菌-酵母混合培养体系生产丁醇试验，结果如表1、图2C及图4A所示。

与对照相比，混菌培养批次(#c)的丁醇浓度从11.63 g/L提高到11.91 g/L，丁醇/丙酮比从1.98上升到2.22，提高幅度有限。此时，乙醇浓度增加到8.42 g/L，成为发酵第2位产物。与批次#b类似，批次#c中苯丙氨酸、酪氨酸和蛋氨酸浓度逐渐增加，但赖氨酸基本没有积累。此时，各氨基酸浓度均低于批次#b的水平。因8.42 g/L的乙醇对梭菌生存不会产生致命影响和环境胁迫作用，参照对照结果可知，批次#c的氨基酸分泌应主要来源于酵母。与对照相比，梭菌胞内外的氨基酸存在浓度梯度，但批次#c中的胞外氨基酸浓度较低，即便上述氨基酸全部跨膜进入梭菌胞内，其积累量也达不到批次#b的水平。因此，单纯的共混培养体系无法提高梭菌胞内的氨基酸积累和吸收/利用。

●丁醇；▲丙酮；■乙醇；○丁酸；△葡萄糖

GLC→2EtOH+2CO2

(2)

(3)梭菌代谢合成ABE化学计量式[12]：

GLC→0.63BtOH+0.315ACE+0.11EtOH+

2.32CO2+1.26H2+0.32H2O

(3)

全部的NADH和大部分的CO2均来自于GLC→Acetyl-CoA及电子穿梭系统。乙醇合成支路紧靠Acetyl-CoA节点，且与复杂的丁酸/乙酸生成/再吸收闭环回路没有关联。梭菌胞内的乙醇和CO2的化学计量关系刚性较强、受混合培养的影响不大。混合培养下，乙醇和CO2依旧存在公式4～5的关系。这里，GLC、BtOH、ACE和EtOH代表葡萄糖、丁醇、丙酮和乙醇。

(4)

根据以上关系，γ即可由公式(6)计算得到：

(6)

(7)

这里，γ=0为梭菌ABE发酵，ΔT、N和MWEtOH分别为采样间隔、采样数和乙醇分子量。

(A)：○批次#a；■批次#b；…批次#c；—批次#d；

2.3丁酸胁迫与梭菌-酵母混合培养体系大幅提高ABE发酵性能

当ABE发酵至24 h时，实施上述耦联式发酵策略，厌氧瓶中的丁醇浓度、丁醇/丙酮比、总溶剂浓度达到16.34 g/L、2.97、25.34 g/L的最高水平。发酵罐中，丁醇浓度和丁醇/丙酮比也达到15.74 g/L和2.83的最高水平，相比对照提高了35%和43%。总溶剂浓度和生产效率分别从18.77 g/L和0.29 g/L/h提高至25.15 g/L和0.52 g/L/h。酵母代谢活性得到适度抑制，乙醇浓度仅为3.84 g/L，发酵性能显著改善。

从氨基酸分泌模式(图2D)看出，批次#d中蛋氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸浓度仅为批次#b和批次#c的叠加，而赖氨酸分泌量却大幅提升。与对照相比，赖氨酸从1.67 mg/L增加到45.9 mg/L，提高了27.5倍。虽然尚无法确定赖氨酸是来自于梭菌、酵母还是二者共同分泌，但即便来自于酵母(最不直接的分泌方式)，大量游离赖氨酸若进入梭菌胞内，将营造利于丁醇合成的胞内氨基酸环境。同时，类似的赖氨酸大幅分泌现象也出现在乙酸耦联梭菌-酵母混合培养的ABE发酵中[13]。

2.4丁酸胁迫与梭菌-酵母混合培养的ABE发酵策略的工业应用潜力

ABE发酵生产中，在提高/维持总溶剂生产效率的前提下，进一步提高丁醇浓度或丁醇比率是重新启动ABE发酵工业的关键性因素。据报道，当丁醇浓度从12 g/L提高至19 g/L时，丁醇分离成本将降低50%[1]。本文使用的新型ABE发酵策略使丁醇浓度从11.63 g/L提高至15.74 g/L，降低了后期分离纯化成本。虽然表观丁醇比率从62%提高到63%，但超过70%的乙醇是由酵母代谢产生(图5A和表1)。使用上述新型发酵策略，梭菌细胞代谢产生的丁醇比率从62%提高到70%，来自于梭菌的丁醇∶丙酮∶乙醇实际上提升到70∶23∶7 (w/w)的高水平。由酵母代谢的过量乙醇虽然降低了表观丁醇比率，但提高了丁醇、总溶剂浓度和生产效率，以及整体发酵性能。有研究者采用离线萃取-共沸蒸馏法一次性将82%的总溶剂精制，丁醇、丙酮和乙醇得率分别为96%、64%和50%[3]。蒸馏精制所得溶剂混合物可直接作为高效柴油添加剂使用，其中丁醇比例越高，柴油点火性能越好，质量等级越高[15]。根据计算，传统ABE发酵(B∶A∶E=6∶3∶1)，柴油添加剂中B∶A∶E比例在70∶24∶6(w/w)左右，而使用上述新工艺，通过改变发酵液中B∶A∶E比例，可将蒸馏精制得到的溶剂混合物中B∶A∶E比例提升至74∶17∶9(w/w)的高水平。该新型ABE发酵策略在提高生产效率同时，能够进一步改善发酵产品质量，具有工业应用的潜力。

粗实线：强化的途径；点划线：弱化的途径；点线：氨基酸积累和再吸收途径

3结论

提出了外添丁酸耦联梭菌-酵母混合培养提高ABE发酵性能的新工艺。该策略可诱导赖氨酸的大量分泌，提高梭菌对底物利用的竞争能力，产生更多用于丁醇合成的NADH。最终丁醇浓度、丁醇/丙酮比和总溶剂生产效率分别达到15.74 g/L、2.83和0.52 g/L/h的最高水平。

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Enhanced ABE fermentation performance by co-culturingC.acetobutylicum/S.cerevisiaecoupling with butyrate addition and stress

HE Zhen-ni1, GE Lai-bing2, LUO Hong-zhen1, ZHANG Jing-shu2, ZHAO Yan-li3,DUAN Zuo-ying1, SHI Zhong-ping1

1. School of biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122; 2. China Shijiazhuang Pharmaceutical Group Co., Ltd.,Shijiazhuang, Hebei 050035; 3. Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd., Shijiazhuang, Hebei 050800

AbstractIn order to enhance acetone-butanol-ethanol (ABE) fermentation performance, a novel strategy of co-culturing C. acetobutylicum/S. cerevisiae coupling with exogenous butyrate addition and stress was proposed and conducted in a 7 L anaerobic bioreactor. During solventogenic phase of ABE fermentation by adding 0.2 g-DCW/L-broth of S. cerevisiae and 4.0 g/L-broth concentrated butyrate solution into C. acetobutylicum culture broth in one time (24 h), butanol concentration, butanol/acetone ratio and ABE productivity largely increased by 35%, 43% and 79% as compared with those of the control, and reached the highest levels of 15.74 g/L, 2.83 and 0.52 g/L/h, respectively. If the purified ABE solvents mixture could be directly used as the diesel additive, the B∶A∶E ratio would vary and reach a higher level of 74∶17∶9 (w/w), and the significant quality improvement of the additive product could be expected. Theoretical and experimental analysis revealed that the proposed strategy could extensively induce lysine secretion and its assimilation/utilization in C. acetobutylicum, promote C. acetobutylicum tolerant ability against high butanol environment and butanol synthesis; simultaneously enhance the competitive ability of C. acetobutylicum on substrate utilization and the reductive power originated from the electron transport shuttle system, to induce more intercellular NADH oriented for butanol synthesis in C. acetobutylicum metabolism. The synergetic actions of effective lysine assimilation and high NADH utilization rate desirable for butanol synthesis enhanced the ABE fermentation performance.

Key wordsbutanol; Clostridium acetobutylicum; butyrate; lysine; NADH

作者简介：何珍妮(1990～)，女，硕士研究生。E-mail：zhn_he@163.com。 *通讯作者：史仲平，男，博士，教授，博士生导师。Tel：0510-85918292，E-mail：zpshi@jiangnan.edu.cn。

项目名称：国家自然科学基金(20976072)。