高产Monacolin K纯种红曲培养条件的研究

郭晓旭，　袁朝琪，　李国莹，　余晓斌

江南大学生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122

高产Monacolin K纯种红曲培养条件的研究

郭晓旭，袁朝琪，李国莹，余晓斌*

江南大学生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122

摘要：本实验对已有的十株红曲霉菌株进行纯种制曲，筛选出一株生长良好、Monacolin K含量高、不产桔霉素、产色素能力强及糖化酶活力相对较高的红曲霉菌株。以大米为原材料，采用液固联合制曲法，通过单因素实验对纯种红曲的培养条件进行优化。结果表明，固体培养基初始含水量为45%，接种量为8%，变温培养红曲时，红曲霉M-7所得纯种红曲最佳，其Monacolin K含量高达243 μg/g，色价450 U/g，糖化酶活力4 289 U/g。与优化之前比较，Monacolin K含量提高了37.2%。

关键词：红曲霉； 纯种红曲； 液固联合； Monacolin K

红曲霉是我国最早用于食品加工的有益真菌之一，主要应用于酿酒、制醋、着色和中药制品等[1]。红曲是红曲霉属经固态发酵制备而成的紫红色米曲，起源于中国，有一千多年的历史，是一种传统发酵产品。在中国，红曲大部分产自福建、台湾、浙江等地，其中以福建古田红曲最为著名。许多中药典集中有记载红曲具有活血调气、健脾燥胃等功效，主要用于医治妇女产后恶血不净、食积饱胀等症。红曲因其纯天然的保健特性，应用范围极广，包括食品类(酒类、肉制品、食醋、酱油等)、医药类(中医药、功能性保健品)、化妆品、饲料添加剂等[2]。

红曲中含有红曲霉产生的多种代谢产物，包括红曲色素，Monacolin K，γ-氨基丁酸等[3]。20世纪70年代，日本远藤章等[4]从红曲霉培养液中发现并分离得到能够抑制胆固醇合成的Monacolin K类活性物质，之后几年又陆续发现Monacolin K 的结构类似物Monacolin L、J、X、M及其衍生物等，研究发现此类物质同样具有降低胆固醇、降血糖和血压、防癌等功效，但活性均不如Monacolin K[5]。目前国内外对Monacolin K的研究一般都处于实验室阶段，还没有完全将其应用于功能性保健品的开发。

本实验主要对筛选得到的红曲霉进行纯种制曲，采用液固联合制曲法[6,7]，以MonacolinK含量为主要指标，同时参考色价，糖化酶活力等，确定纯种红曲的最佳培养条件[8]，以期为Monacolin K的工业化生产提供理论依据和技术支持。

1材料与方法

1.1材料

10株红曲霉菌株，分别编号为M1-M10(由酶工程与技术实验室保存)；

大米(市售)；

1.2实验室自制纯种红曲工艺流程

1.3纯种红曲中各指标的测定

1.3.1Monacolin K含量测定

采用高效液相色谱法：色谱柱 ZORBAX SB C18(5 m ×250 mm×4.6 mm)；流动相 甲醇∶磷酸∶水=385∶0.14∶115(v∶v)；紫外检测器波长 238 nm；柱温20 ℃；流速 1 mL/min[9]。

1.3.2桔霉素的测定

采用高效液相色谱法：色谱柱 Eclipse XDB Reversed-phaseC18(5 m ×250 mm×4.6 mm)；流动相 水∶乙腈= 65∶35(v∶v)(磷酸调pH为2.5)；紫外检测器波长 254 nm；流速 1 mL/min；柱温28 ℃[10]。

1.3.3色价的测定

采用分光光度法，505 nm处测定红曲的色价，以70%乙醇溶液为空白对照[11]。

1.3.4红曲糖化酶活力测定

1 g固体样品(或1 mL液体样品)，置于40 ℃，PH 4.6的条件下，1 h分解可溶性淀粉产生1 mg葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/g表示。红曲糖化酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法[12]。

2结果与讨论

2.1较优红曲霉菌株的筛选

将实验室10株红曲霉菌株纯种制曲得到成熟的红曲米。测定各菌株所制成红曲的Monacolin K含量、桔霉素含量、色价及糖化酶活力，从中选出优良菌株。

2.1.1不同菌株制曲后产Monacolin K和桔霉素的测定

测定各菌株所制成纯种红曲的Monacolin K和桔霉素含量，结果如表1所示。

表1　不同菌株产Monacolin K和桔霉素情况的比较

注：“—”表未检出。

由表1可知，在10株菌株中，有8株含有Monacolin K，其中红曲霉M-2、M-6、M-7、M-8及M-9发酵产Monacolin K量相对较高，但是M-8及M-9号菌株产生桔霉素。综合考虑，选择红曲霉M-2、M-6及M-7作为下一步的研究对象。

2.1.2制曲后红曲质量、色价及糖化酶活力鉴定

对红曲霉M-2、M-6及M-7进行纯种制曲，观察红曲的生长状况，并对其色价和糖化酶活力进行测定，结果见表2。

表2　不同菌株制曲后质量、色价和糖化酶活力比较

如表2所示，所选三株红曲霉所制红曲色泽深红，米粒断面亦呈红色，且各菌株产色素能力和糖化酶活力相差不多，但红曲霉M-7产Monacolin K的能力最强，达178 μg/g。综合考虑，选择M-7为最佳的红曲霉。

2.2纯种红曲培养条件的优化

以Monacolin K含量、色价和糖化酶活力为指标，优化M-7菌株纯种制曲时各项工艺的参数，从而制得质量上佳的红曲。

2.2.1红曲培养初始含水量的确定

固态发酵培养基的含水量是影响红曲霉生长的重要因素之一。水份含量过高，使氧气的供应受到抑制，反之则会使红曲霉的生长受到影响。故研究培养基初始不同含水量对红曲霉生长的影响，确定培养基最佳的初始含水量。

图1　初始含水量对红曲Monacolin K含量、

由图1观察发现，随着培养基初始含水量的增加，色价、Monacolin K含量及糖化酶活力逐渐增长，当培养基的初始含水量大于45%时，色价、Monacolin K含量及糖化酶活力渐渐降低，同时明显观察到红曲处于黏湿的环境中。红曲的色价、Monacolin K含量及糖化酶活力随着水分含量的升高会受到抑制，可能是高浓度的水份含量使培养基透气性变差而不利于红曲霉的次级代谢。综合红曲培养过程中Monacolin K含量、糖化酶活力及红曲色价的变化，45%的初始含水量为最佳选择。

2.2.2红曲培养温度的确定

温度是Monacolin K合成的关键因素。低温(20 ℃～25 ℃)有利于红曲霉产生Monacolin K，高温(30 ℃～35 ℃)则适合红曲霉的生长[13]。比较不同培养温度对红曲产Monacolin K的影响，确定红曲的培养温度，结果见图2。

图2　温度对M-7产Monacolin K的影响

由图2可以看出，在恒温培养中，红曲霉M-7产Monacolin K的最适温度是26 ℃，产量达232.8 μg/g，而在变温培养下(30 ℃7 d，23 ℃5 d)，红曲Monacolin K产量可高达248 μg/g。因此，变温培养为最佳的培养方式。

2.2.3红曲培养时间的确定

将M-7菌株纯种制曲，在红曲培养过程中分别在3 d、5 d、7 d、9 d、10 d、11 d、l2 d、13 d、14 d测定其Monacolin K含量、糖化酶活力及红曲色价，从而确定最佳培养时间。

图3　培养时间对红曲Monacolin K含量、

从图3观察发现，随着红曲培养时间不断增加，Monacolin K的含量持续增加，同时糖化酶活力和红曲色价也逐渐增加。Monacolin K的含量在第12 d达到最大后趋于稳定；糖化酶活力在第10 d达到最高值后下降；同时红曲色价在第9 d达到最高，之后趋于稳定。结合各种指标的变化趋势，确定红曲的最佳发酵时间为12 d。

2.2.4红曲霉液体接种量的确定

将红曲霉液体种子液分别以2%、4%、6%、8%、10%的接种量接种于大米固体培养基中，测定成熟红曲米的Monacolin K含量、糖化酶活力及其色价。

图4　接种量对红曲Monacolin K含量、

从图4可以看出，随着接种量的增加，所制成红曲的Monacolin K含量、糖化酶活力及色价均增加。当接种量到达8%时，Monacolin K含量和色素含量均达到最高值并且趋于稳定，同时在接种量为6%时糖化酶活力达到最大，随后缓慢下降，综合各方面综合考虑，最佳接种量为8%较适宜。

2.3最佳发酵条件的验证实验

在优化了纯种红曲的培养条件之后，做三组平行实验，验证在最优发酵条件下的Monacolin K产量、色价及糖化酶活力，结果见表3。

表3　最优条件验证实验

从表3可以看出，在最优发酵条件下，M-7固态发酵的Monacolin K产量达到243 μg/g，比优化之前Monacolin K的产量提高37.2%；色价为450 U/g，提高7.6%；糖化酶活力为4 289 U/g，提高4%。

3结论

1. 对已有的十株红曲霉菌株进行纯种制曲，对比各菌株制曲后产Monacolin K、色价、糖化酶活力及产桔霉素的能力，从中筛选出一株生长良好、Monacolin K含量高、不产桔霉素、产色素能力强及糖化酶活力相对较高的红曲霉菌株。最后筛选得到M-7菌株。利用红曲霉M-7制得的纯种红曲，出曲后色泽深红，米粒断面亦呈深红色，不产桔霉素，Monacolin K含量为178 μg/g，糖化酶活力高达3 918 U/g，色价406 U/g。

2. 对红曲霉M-7进行纯种制曲，并对其培养条件的参数进行优化，以大米为原材料，采用液固联合制曲法，固体培养基的初始含水量为45%、红曲霉液体接种量为8%，同时变温培养红曲，成熟红曲米粒饱满、呈酱紫色且米粒断面亦呈深红色，Monacolin K含量高达243 μg/g，色价450 U/g，糖化酶活力4 289 U/g，Monacolin K含量、色价及糖化酶活力分别比优化之前提高了37.2%、7.6%、4%。

参考文献

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Study on cultivation conditions for pure red starter with high-yielding monacolin K

GUO Xiao-xu, YUAN Zhao-qi, LI Guo-ying, YU Xiao-bin

Key Lab of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,iangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China

AbstractThe pure red starters with screening monascus preserved by laboratory were made and then the strain, which was citrinin-free, with high-yielding pigment, glucoamylase activity and monacolin K was selected. Furthermore, the culture conditions of the red starter were optimized through single factor experiments, which used liquid-solid union to make red starter with rice as raw material. The results showed that the mature red starter made with monascus M-7 looked best under the conditions of the original water content of 45%, monascus liquid quantity of 8% and cultivating at different temperature. Monacolin K content was up to 243 μg/g, the pigment yield was 450 U/g and glucoamylase activity was 4 289 U/g. After optimization, monacolin K content was improved 37.2%.

Key wordsmonascus; pure red starter; liquid-solid union; monacolin K

作者简介：郭晓旭(1989～)，女，硕士研究生，E-mail: dfgxx880101@163.com。 *通讯作者：余晓斌(1965～)，男，博士，教授，E-mail: xbyu@jiangnan.edu.cn。