发酵罐中利用黑曲霉菌丝球处理豆制品废水的研究

张　燕，　刁宁宁，　黄勋娟，　张建国,2*

1.上海理工大学 食品科学与工程研究所，上海 200093,2.工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室(天津科技大学)，天津 300457

发酵罐中利用黑曲霉菌丝球处理豆制品废水的研究

张燕1，刁宁宁1，黄勋娟1，张建国1,2*

1.上海理工大学 食品科学与工程研究所，上海 200093,2.工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室(天津科技大学)，天津 300457

摘要：利用黑曲霉菌丝球处理豆制品废水的优点是黑曲霉安全性好、菌丝球易收获、利于降低成本且可以减少传统处理方式所产生的污泥量。在前期研究的基础之上，在搅拌式发酵罐中考察了黑曲霉菌丝球降低豆制品废水化学需氧量(COD)的条件。研究结果表明，当豆制品废水初始COD在2×103 mg/L，黑曲霉孢子浓度为1.44×103/L时，黑曲霉的菌丝能够在搅拌式发酵罐中形成形态均一的菌丝球，同时可将废水的COD降至842 mg/L，COD去除率达55.7%。该研究结果为在搅拌式发酵罐中利用黑曲霉菌丝球处理豆制品废水提供了参考依据。

关键词：豆制品废水； 黑曲霉； 菌丝球； 化学需氧量

黑曲霉是一种菌丝体呈绒毛状、网状或絮状的丝状真菌，在工业上应用广泛。美国食品药品监督管理局(FDA)批准由黑曲霉生产的产物是食品级安全的产品(Generally Regard As Safe)[1]。黑曲霉被广泛用于生产胞外酶和有机酸[2]，如葡糖淀粉酶、果胶酶和半乳糖苷酶等。在深层发酵过程中，黑曲霉形成菌丝球形态使柠檬酸产量提高[3]，控制菌丝形态能有效的控制黑曲霉的代谢产物[4]。黑曲霉还可用于污水处理[5]，能够有效降解废水中的有机物质，吸附色素并降低废水的化学需氧量(COD)[6]。黑曲霉的菌丝球具有厌氧颗粒污泥和好氧颗粒污泥所不具备的诸多优点[7]，例如沉降速度快、易于固液分离、应用广泛等。Silva等利用黑曲霉菌株AN400在间歇反应器中处理乳品废水[8]。Hernandez等利用黑曲霉菌株UO-1处理不同淀粉浓度的啤酒和肉制品废水[9]。

在工业发酵越来越流行的今天，发酵工程也越来越目标化、精细化、自动化[10]。这要求对发酵工艺的数学模型和优化技术进行研究，并考虑形态上培养液流变学和质量传递的影响，从而实现按比例放大发酵工艺，并建立完善的控制工艺参数[11, 12]。考虑到各种生物反应器的流动模式有所区别，可以假设，在实验室规模的生物反应器中培养液能混合完全，而在用于工业生产的大规模生物反应器中则需一定混合时间才能达到95%的均一性[13]。培养液混合程度、葡萄糖、pH值和温度梯度对发酵过程均有显著影响[14, 15]。如果培养液混合程度过低，会影响培养基的氧含量，进而影响发酵[16]。本文对发酵罐中黑曲霉降低豆制品废水COD的培养条件进行研究，确定黑曲霉形成菌丝球同时降低豆制品废水COD的条件，为后续扩大培养规模奠定了基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1废水、试剂和设备

豆制品废水取自上海清美绿色食品有限公司。化学药品购自国药集团化学试剂有限公司。发酵罐(BLBIO-2L，2L)购自上海百伦生物科技有限公司。

1.1.2菌株与培养基

黑曲霉菌株(TCCC4002)取自工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室(天津科技大学)。马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(g/L)：马铃薯葡萄糖琼脂培养基固体55，115 ℃灭菌20 min。察氏培养基(g/L)：无水葡萄糖2.5，NaNO33，K2HPO4·3H2O 1，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，pH 5.6，115 ℃灭菌20 min。

1.2方法

1.2.1菌体保藏

用无菌蒸馏水洗下PDA培养基上的黑曲霉孢子，制备孢子悬浮液。将悬浮液与50%甘油按1∶1(v/v)混合均匀，分装后置-70 ℃保存。每月重新活化后保存。

1.2.2黑曲霉菌丝球的制备

1.5 L豆制品废水用NaOH溶液调pH至5.5后倒入发酵罐，115 ℃灭菌20 min。冷却后接种。发酵罐转速300 r/min，通气量1 vvm，温度30 ℃。考察孢子浓度对黑曲霉降低豆制品废水COD的影响时，孢子接种浓度分别为3.52×104、1.41×104、3.52×103、7.04×102和70.4 /L。考察转速的影响时，转速梯度选取150 r/min、200 r/min、250 r/min、400 r/min，30 ℃，pH 4.5，通气量1vvm，孢子浓度7.04×102/L。考察豆制品废水浓度的影响时采用稀释的方法，向不同稀释倍数的废水中添加营养元素(表1)，黑曲霉孢子浓度1.44×103/L。

表1　不同稀释倍数豆制品废水中营养

1.2.3孢子浓度对豆制品废水处理的影响

发酵罐转速200 r/min，初始pH 5.5，温度30 ℃。豆制品废水稀释10倍后添加营养元素(见表1)。孢子浓度分别为1.44×107、1.44×106、1.44×105、7.20×104、1.44×103/L。其它条件同1.2.2。

2结果与分析

2.1孢子浓度对黑曲霉降低豆制品废水COD的影响

黑曲霉孢子浓度对降低豆制品废水COD的影响见图1。从图中可看出，培养72 h，当孢子浓度在70.4～3.52×104/L范围内时，可不同程度的降低豆制品废水的COD。五个批次(孢子浓度从高到低)的COD降低幅度分别为20.9%、20%、46%、32.9%、35.8%。孢子浓度为3.52×103/L时COD降低幅度最大。但五个批次的培养均未能形成均一的菌丝球。

图1　孢子浓度对黑曲霉降低豆

2.2转速对黑曲霉降低豆制品废水COD的影响

分别采用转速150 r/min、200 r/min、250 r/min和400 r/min进行培养，72 h后菌丝均呈无序状。豆制品废水COD降低幅度依次为3.2%、21.1%、16.6%、-2.2%。200 r/min～250 r/min之间黑曲霉生长状况较好，废水COD有较显著的降低。当转速为400 r/min时，COD没有降低，这可能是因过高转速影响了菌丝的生长(图2)。

2.3稀释倍数对黑曲霉在豆制品废水中降低COD的影响

将豆制品废水稀释不同倍数后添加营养元素(硝酸钠、磷酸氢二钾、碳酸钙、七水合硫酸镁)至初始豆制品废水中主要营养元素的浓度。黑曲霉孢子的接种浓度为1.44×103/L。培养72 h之后，稀释2、5和10倍的豆制品废水和原豆制品废水的COD降低幅度分别为4.3%、22.8%、10.4%、24.2%。经过168 h培养后稀释5、10倍的豆制品废水COD分别为47.0%和37.3%。最终COD分别降低到842 mg/L和1.74×103mg/L(图3)。观察菌丝球的形态可以发现，稀释倍数越大，菌丝球形态越均匀。提高稀释倍数降低了培养液的粘度，改善了培养液的流动特性，因此可以形成更加均匀的菌丝球。

图2　转速对黑曲霉降低豆制品废水COD的影响

图3　稀释倍数对黑曲霉在豆制品废

2.4孢子浓度对稀释后豆制品废水COD的影响

将豆制品废水稀释10倍后添加营养元素(硝酸钠、磷酸氢二钾、碳酸钙、七水合硫酸镁)，调整pH至5.5。孢子浓度对稀释后豆制品废水COD的影响见图4。从图中可看出，废水COD随时间延长显著降低。72 h培养后，按孢子浓度从高到低，废水COD降低幅度分别为22.7%、19.1%、22.4%、22.5%、24.2%。孢子浓度为7.20×104/L时，经过144 h培养，COD降低至821 mg/L。孢子浓度为1.44×103/L时，经168 h的培养，COD降低至842 mg/L。菌丝球形态均匀，直径没有明显变化。孢子浓度高于1.44×105/L时，孢子浓度越高形成的菌丝球越多，经过84 h培养后，菌丝球出现裂解、分散的现象。这可能是搅拌桨对菌丝球造成破坏的结果。图5是稀释10倍后豆制品黄降水中形成的黑曲霉菌丝球，以及经过处理后的豆制品废水。从图中可看出，菌丝球形态均一，易于收获，经菌丝球处理后的豆制品废水澄清。

图4　孢子浓度对稀释后豆制品废水COD的影响

(a)

(b)　　　　　　(c)　　　　　　(d)

3结论

当前有关丝状真菌菌丝球形态的研究报道较多，尤其是关于黑曲霉的菌丝形态[17]。黑曲霉可被用于发酵生产柠檬酸，不少学者关注400 μm直径的黑曲霉菌丝球[18]，是因为黑曲霉生产柠檬酸时最佳形态是形成400 μm直径的菌丝球，当直径超过400 μm时会出现氧气传递的限值[19]。丝状真菌在摇瓶中形成较大菌丝球的现象比较普遍，但在发酵罐中形成菌丝球的报道较少，是目前研究的一个热点。黑曲霉菌可以代谢豆制品废水中的营养物质，且菌丝球体积较大、易于收获，本研究利用黑曲霉菌来处理豆制品废水，在发酵罐条件下，对影响黑曲霉菌菌丝球形成的条件进行了研究。基于豆制品废水简单操作的原则，考察了孢子浓度、转速、营养水平对黑曲霉形成菌丝球的影响。研究发现，调整豆制品废水的营养水平可使黑曲霉形成形态均一的菌丝球。当豆制品废水COD为2×103mg/L，孢子浓度为1.44×103/L时，在搅拌式发酵罐中黑曲霉能形成形态均一的菌丝球，此时COD可降至842 mg/L，COD去除率55.7%。在豆制品企业中，高浓度废水经板框过滤、初沉池后，COD约为(2～3)×103mg/L，所以本研究中黑曲霉形成菌丝球时的营养水平与豆制品企业的实际工艺参数相近。不足之处是COD去除率较低，这可能是由于小型发酵罐中溶氧的限制，导致黑曲霉菌代谢速率较慢。在后继研究中，将发酵规模放大，改善溶氧水平后，有望提高豆制品废水的COD去除率。

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Soybean product wastewater treatment byAspergillusnigerthrough pellet formation in fermentor

ZHANG Yan1, DIAO Ning-ning1，HUANG Xun-juan1，ZHANG Jian-guo1,2

1.Institute of Food Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, P.R.China；2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology (Tianjin University of Science & Technology,Ministry of Education, Tianjin, 300457, P.R.China

AbstractAspergillus niger pellet is a good approach for soybean wastewater treatment because of its good safety record, easy recovery of pellets morphology, low cost and low sludge production. On the basis of previous research, Aspergillus niger was cultivated in mechanical agitated fermentor to form pellets and treat soybean wastewater. The condition of reducing chemical oxygen demand (COD) of wastewater by using Aspergillus niger pellets was investigated. Research results showed that when the initial COD of wastewater and initial spore concentration were 2×103 mg/L and 1.44×103/L respectively, the uniform mycelium pellets could be observed in the fermentor. COD reduced to 842 mg/L and the removal rate of COD reached 55.7%. This result provided a reference basis for treating soybean wastewater using Aspergillus niger pellets in stirring-type fermentor.

Key wordssoybean products wastewater; Aspergillus niger; pellets; chemical oxygen demand

基金项目：国家自然科学基金(No.21306112)；上海市自然科学基金资助项目(No.13ZR1429100)；上海高校青年教师培养资助计划(No.slg14037)；教育部留学回国人员科研启动基金；工业发酵微生物教育部重点实验室暨天津市工业微生物重点实验室(天津科技大学)开放基金资助项目(No.2013IM002);上海市研究生教育创新计划资助。

作者简介：张燕(1991～)，女，硕士研究生；研究方向：微生物过程工程。E-mail：zhangyan399@foxmail.com。 *通讯作者：张建国，男，副教授。Tel：86-21-55803272，E-mail：jgzhang@usst.edu.cn。